SHIP1調(diào)控STAT3信號(hào)通路對(duì)白血病Jurkat細(xì)胞活力和凋亡的影響

方 鵬， 張諾芳

(河南省開(kāi)封市兒童醫(yī)院PICU， 河南 開(kāi)封 475000)

白血病又稱為血癌，是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤。目前白血病常見(jiàn)治療方法為化療，隨著治療手段的不斷改進(jìn)，化療雖然取得了一定的效果，但是部分白血病患者出現(xiàn)多藥耐藥的現(xiàn)象，并且部分患者經(jīng)過(guò)化療治療后會(huì)出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥[1-3]。近年來(lái)，靶向基因治療白血病具有針對(duì)性強(qiáng)和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為應(yīng)用前景最好的方法之一，因此， 尋找有效的靶基因治療白血病是目前研究的重要內(nèi)容。

含SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇5-磷酸酶1(SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1，SHIP1)是肌醇5-磷酸酶家族成員之一，參與血液疾病的發(fā)生[4-6]。有研究表明，SHIP1的mRNA在白血病患者中表達(dá)水平明顯降低，參與小鼠骨髓增殖性疾病的發(fā)生過(guò)程，對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖也具有重要調(diào)控作用[7]。本研究以白血病細(xì)胞為研究對(duì)象，運(yùn)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等方法探討SHIP1對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，以期為靶向基因治療白血病提供新思路。

材 料 和 方 法

1 主要材料

白血病細(xì)胞Jurkat購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；空載體pEGFP和SHIP1過(guò)表達(dá)載體pEGFP-SHIP1購(gòu)自于吉滿生物科技(上海)有限公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自Thermo；RPMI-1640購(gòu)自Sigma；SHIP1和β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；抗活化的caspase-3(cleaved caspase-3)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和p-STAT3單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗SHIP1單克隆抗體購(gòu)自LSBio；real-time PCR試劑盒購(gòu)自KAPA Biosystems；STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490購(gòu)自Thermo。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 白血病細(xì)胞Jurkat用含有10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為飽和濕度、 37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)3 d后換液，按照1∶3的比例傳代。白血病細(xì)胞分為空白對(duì)照(blank control，control)組、陰性對(duì)照(negative control， NC)組和SHIP1組，其中NC組和SHIP1組分別轉(zhuǎn)染空載體 pEGFP和SHIP1過(guò)表達(dá)載體pEGFP-SHIP1，control組不做處理。白血病細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，調(diào)整細(xì)胞懸浮液為2×107/L，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μL細(xì)胞懸浮液，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞融合度為60%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。步驟參照轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

2.2Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果 Control組、NC組和SHIP1組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，按照每毫升加入1 mL的Trizol裂解液，混合后，在室溫條件下反應(yīng)5 min，加入200 μL的氯仿溶液，上下劇烈振蕩15 s，靜置反應(yīng)3 min，4 ℃、 12 000 r/min離心15 min，此時(shí)溶液從上到下分為3層，提取的RNA存在于上層水相層中，吸取約500 μL的水相溶液，加入等體積的異丙醇，混合后，于冰上靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入適量的75%的乙醇后，放在超凈工作臺(tái)中晾干，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度(A260/A280比值介于1.8～2.1之間)。用real-time PCR檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。SHIP1 的上游引物序列為5’-GCTGGAGGAAGAGGACACAG-3’， 下游引物序列為5’-AGTCAGCGGGATGTTTCTTG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-CCTTCTACAATGAGCTGCGT-3’， 下游引物序列為5’-CCTGGATAGCAACGTACATG-3’。反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性 5 s, 60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參照為β-actin，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.3Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果 Control組、NC組和SHIP1組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，將培養(yǎng)液上清吸除后，加入蛋白裂解液，充分裂解后，吸取蛋白上清，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。蛋白樣品與上樣緩沖液按照等體積比例混合煮沸5 min，80 V電壓觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠和濃縮膠邊緣時(shí)，將電壓調(diào)節(jié)到120 V，溴酚藍(lán)進(jìn)入到電泳槽的底端時(shí)，關(guān)閉電源。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(100 V恒壓或者300 mA恒流)2 h。用含有5%牛血清白蛋白的封閉液將非特異性的結(jié)合位點(diǎn)封閉，封閉條件為室溫 60 min。棄封閉液，用800倍稀釋的 I 抗在4 ℃結(jié)合過(guò)夜，用辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的 II 抗(2 000倍稀釋)在室溫條件下結(jié)合60 min，顯色，顯影后，根據(jù)蛋白灰度值分析蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 Control組、NC組和SHIP1組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，把細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108/L，按照每孔中加入200 μL的細(xì)胞懸浮液接種到96孔板中，每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔，用PBS將邊緣孔填充。培養(yǎng)48 h后，終止培養(yǎng)，每孔中加入5 g/L的MTT溶液20 μL，放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，1 000 r/min離心5 min，在細(xì)胞沉淀中加入200 μL的二甲基亞砜溶液， 37 ℃振蕩10 min，待結(jié)晶物融化后，進(jìn)行比色(490 nm)。以不加細(xì)胞只加入等量二甲基亞砜的孔為空白組，用于調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=100%×(A轉(zhuǎn)染組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Control組、NC組和SHIP1組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，2 000 r/min離心5 min，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為6×108/L，收集1 mL細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞，加入200 μL的結(jié)合緩沖液，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)和Annexin V-FITC各5 μL，避光，室溫孵育15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.6Western blot檢測(cè)cleaved caspase-3、STAT3和p-STAT3的蛋白水平 Control組、NC組和SHIP1組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，參照2.3中Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中cleaved caspase-3、STAT3和p-STAT3 蛋白水平，其中抗cleaved caspase-3、STAT3、p-STAT3的I 抗均稀釋1 000倍，II 抗稀釋2 000倍，β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.7STAT3信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的影響 用50 μmol/L的STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490分別作用于control組和SHIP1組細(xì)胞，記為control+AG490組和SHIP1+AG490組，培養(yǎng)48 h后，參照上述方法檢測(cè)細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平，檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡情況，同時(shí)control組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞的活力和凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間多重比較用方差齊性檢驗(yàn)，用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)對(duì)兩組之間進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染效果

Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，control組、NC組和SHIP1組SHIP1的mRNA表達(dá)水平依次為 1.02±0.08、0.99±0.12和2.31±0.18，SHIP1的蛋白水平依次為0.45±0.06、0.46±0.07和1.12±0.16。SHIP1組細(xì)胞中SHIP1 mRNA和蛋白水平均明顯高于control組和NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖1、表1。

2 SHIP1對(duì)細(xì)胞活力的影響

Figure 1. The protein levels of SHIP1 in transfected cells detected by Western blot.

圖1Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SHIP1蛋白表達(dá)水平

表1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SHIP1mRNA和蛋白表達(dá)水平

Table 1. The mRNA and protein levels of SHIP1 in transfected cells (Mean±SD.n=3)

GroupmRNAProteinControl1.02±0.08*0.45±0.06*NC0.99±0.12*0.46±0.07*SHIP12.31±0.131.12±0.16

*P<0.05vsSHIP1 group.

MTT結(jié)果顯示，control組、NC組和SHIP1組的細(xì)胞存活率依次為(101.35±6.65)%、(100.91±12.63)%和(69.53±9.53)%。3組數(shù)據(jù)比較差異顯著(F=10.172，P<0.05)， SHIP1組的細(xì)胞存活率明顯低于control組和NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.743，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The changes of the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSHIP1 group.

圖2SHIP1對(duì)細(xì)胞活力的影響

3 SHIP1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，control組、NC組和SHIP1組的細(xì)胞凋亡率依次為(4.65±0.41)%、(4.80±0.74)%和(23.82±2.66)%。3組比較差異顯著(F=140.401,P<0.01)，SHIP1組的細(xì)胞凋亡率明顯高于control組和NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 SHIP1對(duì)細(xì)胞cleaved caspase-3、STAT3和p-STAT3蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，control組、NC組和SHIP1組的cleaved caspase-3蛋白水平依次為0.25±0.03、0.24±0.05和0.68±0.07；STAT3的蛋白水平依次為0.84±0.07、0.85±0.06和0.86±0.04；p-STAT3的蛋白水平依次為0.34±0.08、0.35±0.05和0.20±0.03。SHIP1組的cleaved caspase-3蛋白水平明顯高于control組和NC組，而p-STAT3的蛋白水平明顯低于control組和NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表2。

Figure 3. The cell apoptosis detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSHIP1 group.

圖3SHIP對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The protein levels of cleaved caspase-3, STAT3 and p-STAT3 determined by Western blot.

圖4Westernblot檢測(cè)cleavedcaspase-3、STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化

表2Westernblot檢測(cè)cleavedcaspase-3、STAT3和p-STAT3蛋白水平變化的定量分析

Table 2. The protein levels of cleaved caspase-3, STAT3 and p-STAT3 determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

GroupCleavedcaspase-3STAT3p-STAT3Control0.25±0.03*0.84±0.070.34±0.08*NC0.24±0.05*0.85±0.060.35±0.05*SHIP10.68±0.070.86±0.040.20±0.03

*P<0.05vsSHIP1 group.

5 STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490對(duì)細(xì)胞活力和凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

MTT法和Western blot結(jié)果示，control組、 control+AG490組和SHIP1+AG490組細(xì)胞存活率依次為 (100.15±9.64)%、(72.31±6.73)%和(56.31±8.92)%；cleaved caspase-3蛋白水平依次為0.14±0.07、0.29±0.06和1.03±0.09；STAT3蛋白水平依次為0.93±0.09、0.95±0.08和0.94±0.09；p-STAT3蛋白水平依次為0.36±0.07、0.22±0.04和0.14±0.03。SHIP1+AG490組的細(xì)胞存活率和p-STAT3蛋白水平明顯低于control+AG490組，而cleaved caspase-3蛋白水平明顯高于control+AG490組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表3。

Figure 5. The effect of STAT3 signaling pathway inhibitor AG490 on the protein levels of cleaved caspase-3, STAT3 and p-STAT3 determined by Western blot.

圖5Westernblot檢測(cè)STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490對(duì)cleavedcaspase-3、STAT3和p-STAT3蛋白水平的影響

表3 STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490對(duì)Jurkat細(xì)胞活力和cleaved caspase-3、 STAT3和p-STAT3蛋白水平的影響Table 3. The effects of AG490 on Jurkat cell viability and protein levels (Mean±SD. n=3)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vscontrol+AG490 group.

6 STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果所示，control組、 control+AG490組和SHIP1+AG490組的細(xì)胞凋亡率依次為(6.32±1.25)%、(21.68±2.69)%和(36.66±4.57)%。3組間數(shù)據(jù)比較差異顯著(F=69.778，P<0.01)，control+AG490組細(xì)胞凋亡率顯著高于control組，SHIP1+AG490組細(xì)胞凋亡率明顯高于control+AG490組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 6. The effect of A490 on the cell apoptosis analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vscontrol+AG490 group.

圖6STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

討 論

白血病是由于造血干細(xì)胞異常導(dǎo)致的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，白血病細(xì)胞在骨髓等造血組織中異常增殖并轉(zhuǎn)移至臨近器官和組織中，導(dǎo)致正常的造血功能受阻，出現(xiàn)出血、感染和貧血等癥狀[8-10]。SHIP1基因定位于2q36～37，能夠負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖，是除了PTEN以外發(fā)現(xiàn)的另外一種肌醇磷酸酶[11]。有研究表明，SHIP1基因缺失的小鼠髓系細(xì)胞大量增殖，并且出現(xiàn)肝臟腫大、脾臟腫大和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)肺部等與慢性粒細(xì)胞白血病相似的癥狀[12]。Brauer等[13]的研究表明，在白血病患者中SHIP1無(wú)論是在轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平均明顯降低；Xue等[14]發(fā)現(xiàn)，在白血病細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-155后，白血病細(xì)胞的凋亡減少，細(xì)胞中SHIP1蛋白表達(dá)減少。這些研究結(jié)果說(shuō)明，SHIP1可能參與白血病的發(fā)生過(guò)程。

本研究以白血病Jurkat細(xì)胞為研究對(duì)象，將細(xì)胞轉(zhuǎn)染SHIP1過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)real-time PCR和Western blot檢測(cè)證實(shí)SHIP1過(guò)表達(dá)載體能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞中SHIP1的mRNA和蛋白表達(dá)；進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡發(fā)現(xiàn)，SHIP1過(guò)表達(dá)能夠抑制白血病Jurkat細(xì)胞的活力，并促進(jìn)Jurkat細(xì)胞凋亡，提示SHIP1能促進(jìn)白血病凋亡，抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)，這與之前的研究報(bào)道相符。

腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡受到多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，其中 caspase是目前公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白家族[15-18]。有研究表明，caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活后，導(dǎo)致caspase-3活化水平升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-21]；Wang等[22]的研究表明，caspase-3參與介導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)生過(guò)程，當(dāng)K562細(xì)胞凋亡增多時(shí)，caspase-3活化水平升高了近3倍。金丹婷等[23]的研究表明，大黃素能夠通過(guò)影響caspase-3的表達(dá)水平誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SHIP1的白血病細(xì)胞中caspase-3活化水平升高，這提示，SHIP1可能通過(guò)促進(jìn)caspase-3活化促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡。

STAT3信號(hào)通路廣泛存在于真核生物體內(nèi)，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡[24-26]。STAT3信號(hào)通路在乳腺癌、胃癌、肺癌和白血病等多種腫瘤中異常激活，后能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[27-29]。李覃等[30]的研究表明，白藜蘆醇能夠通過(guò)降低STAT3磷酸化水平發(fā)揮抗白血病的作用；Kontro等[31]的研究表明，急性淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中STAT3磷酸化水平明顯高于正常人。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SHIP1能夠降低白血病細(xì)胞中p-STAT3的水平，而進(jìn)一步用STAT3信號(hào)通路特異性抑制劑作用后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡增加更多。這提示，STAT3信號(hào)通路參與SHIP1調(diào)控白血病細(xì)胞凋亡過(guò)程。

綜上所述，SHIP1能夠通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路的激活促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，抑制白血病細(xì)胞活力。本研究為進(jìn)一步探討SHIP1在白血病發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)，為靶向SHIP1治療白血病提供了理論基礎(chǔ)。本研究只在體外進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，后續(xù)會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證及探討。

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