miR-153靶向PRDM2基因并通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路影響膀胱癌的侵襲和遷移*

李冠軍， 亞國(guó)偉， 唐正嚴(yán)， 蘇開(kāi)德

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 1泌尿外科， 2腫瘤科， 河南 南陽(yáng) 473000； 3中南大學(xué)湘雅醫(yī)院泌尿外科, 湖南 長(zhǎng)沙 410008； 4常德市第一人民醫(yī)院泌尿外科， 湖南 常德 415003)

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類由 19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，它可以通過(guò)與目標(biāo)基因mRNA的非翻譯區(qū)結(jié)合，起到調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、器官分化和腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲等生物學(xué)行為的作用[1-3]。miR-153是一種重要的miRNA，在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等惡性腫瘤中都有相應(yīng)的異常表達(dá)[4-6]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密不可分的關(guān)聯(lián)。

正性調(diào)控域鋅指蛋白(positive regulatory domain zinc finger protein，PRDM)是鋅指蛋白家族中的重要成員，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性和抑制性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，在腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲和器官分化等過(guò)程中起到重要作用，在腫瘤抑制蛋白家族中占有重要的一席之地[7-8]。

Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號(hào)通路近年在腫瘤侵襲方向的研究備受關(guān)注[9]。干擾素家族、gp130家族、單鏈蛋白家族和部分G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都與JAK/STAT信號(hào)通路有一定的關(guān)聯(lián)，通過(guò)該信號(hào)通路發(fā)揮作用[10-11]。

本研究旨在揭示miR-153和PRDM2在膀胱癌中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 臨床標(biāo)本采集及處理

收集2015年1月～2016年1月在我院手術(shù)切除并且經(jīng)病理檢查確診為膀胱癌組織50例，同時(shí)取配對(duì)正常膀胱組織50例。膀胱癌患者術(shù)前未進(jìn)行放療。腫瘤組織離體后，去除血跡，放入4%多聚甲醛固定。

2 細(xì)胞系和主要試劑

人膀胱癌細(xì)胞系 J82、UM-UC-3、RT4和5637 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基?？筆RDM2、p-JAK2和p-STAT3的 I 抗均購(gòu)自 Abcam；miR-153-mimic購(gòu)自上海吉?jiǎng)P制藥技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自Millipore；PCR試劑盒均購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。

3 方法

3.1免疫組織化學(xué)染色 將石蠟包埋好的組織行 4 μm 連續(xù)切片，60 ℃烤箱中烘烤 3～4 h；二甲苯溶液脫蠟 3 次，每次 15 min，梯度乙醇逐步水化，每次3 min；PBS 洗3次，每次3 min；將切片置入檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)10 min，再置于 PBS 液中浸洗3次，每次3 min；3%過(guò)氧化氫甲醇溶液封閉10 min，PBS 液洗3次，每次3 min；加山羊血清后靜置15 min后滴加 I 抗，4 ℃孵育過(guò)夜；37 ℃下復(fù)溫30 min，PBS+1‰ Tween 20 液浸洗3次，每次3 min；室溫下滴加 II 抗孵育15 min，PBS+1‰ Tween 20 液浸洗3次，每次3 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺后觀察染色情況；蘇木素染色，清水沖洗3次，烘箱內(nèi)烘干，用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。

3.2Western blot實(shí)驗(yàn) 每孔加入30 μg PRDM2蛋白樣品，行10%SDS-PAGE。使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶2 000 TBST稀釋 I 抗(羊抗人PRDM2、p-JAK2和p-STAT3單克隆抗體)，4 ℃過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶5 000)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光檢測(cè)。

3.3qPCR定量檢測(cè)miR-153和PRDM2的表達(dá) 首先合成雙向PCR引物，將反應(yīng)混合液加熱至94～98 ℃保持20～30 s，反應(yīng)溫度降至50～65 ℃時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。miR-153上游引物序列為5’-GGGATGGAGTCGAGGTGCGGCTAAT-3’，下游引物序列為5’-GTAGGCTGAGGAAAGTCGAGCGAGC-3’；PRDM2上游引物序列為5’-AAATGCCGAATGGCGAGCGAGATTA-3’，下游引物序列為5’-TTGAGGGCGTGGGCAGGGAGAAATGC-3’。退火溫度72 ℃，維持20～40 s，繼續(xù)降低至68 ℃，PCR反應(yīng)進(jìn)行30～35個(gè)循環(huán)，68～74 ℃延伸5～10 min。根據(jù)熒光定量試劑盒操作說(shuō)明配制反應(yīng)體系，每組反應(yīng)體系的體積為25 μL， 設(shè)置3個(gè)復(fù)孔， 每組樣本cDNA 均需行目的RNA和內(nèi)參照 GAPDH 熒光定量PCR擴(kuò)增，DNA全部反應(yīng)完畢，計(jì)算mRNA表達(dá)情況。

3.4雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 為進(jìn)一步確證miR-153能夠靶向作用于PRDM2，本實(shí)驗(yàn)將PRDM2的3’UTR區(qū)構(gòu)建突變型螢光素酶報(bào)告基因載體。將螢光素酶報(bào)告載體與miR-153-mimic共轉(zhuǎn)染RT4細(xì)胞36 h后，收獲細(xì)胞。按螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)RT4細(xì)胞螢光素酶活性。相對(duì)螢光素酶活性=螢火蟲(chóng)螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。

3.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力 本實(shí)驗(yàn)所用Transwell小室購(gòu)自BD，小室孔徑為8 μm，底面厚度為8 μm。使用50 μL細(xì)胞培養(yǎng)基平鋪在小室底，Matrigel平鋪在小室上，常溫下凝膠后接種細(xì)胞。將RT4細(xì)胞濃度稀釋為 1×109/L，在小室上層加入300 μL含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，向每個(gè)小室上層加入25 μL的細(xì)胞懸液，然后置于37 ℃孵箱孵育24 h。用無(wú)菌棉簽輕度擦拭上室上層的細(xì)胞，擦拭干凈后用結(jié)晶紫染色10 min，倒去染液，PBS清洗5 min，然后于鏡下觀察并拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到6孔板中，在恒溫孵箱中培養(yǎng)，等細(xì)胞長(zhǎng)滿視野時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用黑色馬克筆于6孔板背后劃線。使用高溫滅菌的20 μL槍頭在孔板上垂直于線劃痕，保證槍頭劃痕時(shí)垂直。劃好后充分沖洗，將殘余懸浮細(xì)胞沖洗掉。然后向孔內(nèi)加入不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于恒溫孵箱孵育。分別于24、48和72 h后在顯微鏡下取點(diǎn)，觀察，拍照。與0 h的初始距離作對(duì)比，分別測(cè)量細(xì)胞遷移的距離，計(jì)算細(xì)胞的遷移率。遷移率(%)=(D24/48/72 h-D0 h)/D0 h×100%。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，膀胱癌組織和正常膀胱組織中的PRDM2陽(yáng)性表達(dá)率采用2檢驗(yàn)比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 膀胱癌中miR-153和PRDM2的差異性表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，PRDM2定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，在膀胱癌組織中表達(dá)水平較高，見(jiàn)圖1A；miR-153在膀胱癌組織中表達(dá)明顯低于正常膀胱組織(P<0.05),見(jiàn)圖1B。50例膀胱癌組織中，43例PRDM2表達(dá)陽(yáng)性；50例正常膀胱組織中，8例PRDM2表達(dá)陽(yáng)性，膀胱癌組織中PRDM2的陽(yáng)性表達(dá)率相對(duì)于正常膀胱組織明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

Figure 1. The expression of PRDM2 (A) and miR-153 (B) in bladder cancer detected by immunohistochemical staining (×20) and qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal bladder tissue group.

圖1PRDM2和miR-153在膀胱癌組織和正常膀胱組織的表達(dá)情況

表1膀胱癌與正常膀胱組織中PRDM2的表達(dá)比較

Table 1. The expression of PRDM2 in bladder cancer tissues and normal bladder tissues (n=50)

GroupPRDM2proteinexpressionPositiveNegativeNormalbladder842Bladdercancer43* 7*

*P<0.05vsnormal bladder.

2 PRDM在不同膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與J82、UM-UC-3和5637細(xì)胞株相比，PRDM2蛋白在RT4細(xì)胞株中表達(dá)最低(P<0.05)，見(jiàn)圖2，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選取膀胱癌細(xì)胞RT4作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

3 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-153與PRDM2的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)軟件(TargetScan)預(yù)測(cè)，miR-153可以調(diào)控PRDM2的表達(dá)。qPCR結(jié)果表明，和對(duì)照組比較，膀胱癌RT4細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-153-mimic后，PRDM2的mRNA水平明顯降低(P<0.05)。為了進(jìn)一步證實(shí)PRDM2是miR-153下游的靶向基因，我們使用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-153后，RT4細(xì)胞PRDM2的轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)下調(diào)(P<0.05)，而將PRDM2的3’-UTR突變后，miR-153的抑制作用消失，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The expression of PRDM2 in different bladder cancer cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRT4.

圖2PRDM2在不同膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)

Figure 3. The expression of PRDM2 was regulated by miR-153. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖3miR-153調(diào)控PRDM2的表達(dá)

4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-153后膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的變化

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-153-mimic組穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯少于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。該結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-153后可以有效抑制膀胱癌RT4細(xì)胞的侵襲能力。

Figure 4. The effect of miR-153 over-expression on the invasion ability of RT4 cells detected by Transwell invasion assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-153對(duì)膀胱癌細(xì)胞RT4侵襲能力的影響

5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-153后膀胱癌細(xì)胞的遷移能力的變化

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC組相比，在24、48和72 h時(shí)，miR-153-mimic組遷移率均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。該結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-34a可以抑制RT4細(xì)胞的遷移能力。

Figure 5. The effect of miR-153 over-expression on the migration ability of RT4 cells detected by wound healing assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-153對(duì)膀胱癌細(xì)胞RT4遷移能力的影響

6 過(guò)表達(dá)miR-153后JAK/STAT信號(hào)通路蛋白水平的變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-153-mimic組中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6。這說(shuō)明miR-153的過(guò)表達(dá)可以有效下調(diào)p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平。

Figure 6. Over-expression of miR-153 down-regulated the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖6過(guò)表達(dá)miR-153后p-JAK2和p-STAT3蛋白水平降低

討 論

最近很多研究都報(bào)道m(xù)iRNA在人類腫瘤中扮演很重要的角色。一般來(lái)說(shuō)，miRNA作為一種腫瘤抑制因子，通過(guò)下調(diào)促癌基因的表達(dá)或者上調(diào)抑癌基因的表達(dá)來(lái)達(dá)到抑癌的作用。miRNA可以參與到生物機(jī)體的很多生物學(xué)進(jìn)程中，比如細(xì)胞分化、增殖和侵襲等[12]。有學(xué)者研究表明，miRNA可以調(diào)控20%～30%的基因的表達(dá)，對(duì)機(jī)體蛋白的平衡表達(dá)提供至關(guān)重要的協(xié)調(diào)作用[13-14]。Yuan 等[15]指出，miR-153在肺癌中可以通過(guò)抑制AKT的表達(dá)起到抑癌作用；Ghasemi等[16]報(bào)道在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-153可以下調(diào)Bcl的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；Niu等[17]的研究表明miR-153T可以上調(diào)TGF-β2的表達(dá)影響骨肉瘤細(xì)胞株的生物學(xué)行為。 但是miR-153在膀胱癌中的表達(dá)及影響機(jī)制目前尚未有研究報(bào)道。

PRDM與腫瘤關(guān)系密切，由于PRDM基因啟動(dòng)子甲基化、基因缺失和基因突變等原因?qū)е碌鞍妆磉_(dá)變化，某些抑癌基因失活，導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生。PRDM家族基因在大部分腫瘤中扮演抑癌基因的角色。PRDM2基因包括內(nèi)外2種啟動(dòng)子，外部啟動(dòng)子產(chǎn)物為缺失的短鏈PRDM2蛋白，通過(guò)基因甲基化影響后續(xù)轉(zhuǎn)錄過(guò)程起到抑制腫瘤的作用。通常來(lái)說(shuō)，短鏈PRDM2蛋白是PRDM2的主要表達(dá)形式，一旦出現(xiàn)基因突變或失活的情況，PRDM2表達(dá)水平降低甚至出現(xiàn)表達(dá)缺失的情況，則不能有效抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。Wu等[19]研究PRDM2基因與腫瘤的關(guān)系，檢測(cè)了膀胱癌細(xì)胞株的基因表達(dá)情況，其研究均未檢測(cè)RT4細(xì)胞。

STAT在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞系中廣泛存在，在正常組織中很少出現(xiàn)STAT及其家族蛋白的活化情況[20]。比如在多種鱗狀細(xì)胞癌、淋巴瘤、肺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、胰腺癌和宮頸癌中均有大量文獻(xiàn)報(bào)告存在STAT的活化現(xiàn)象。而JAK則是負(fù)責(zé)活化STAT的酪氨酸激酶[21-23]。STAT家族中的STAT3蛋白，廣泛存在于多種腫瘤組織中，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等一系列的生物學(xué)行為，扮演促癌基因的角色。作為STAT3上游的JAK因子，有報(bào)道指出，通過(guò)使用SG490(JAK體外阻斷劑)可以減緩急淋白血病的發(fā)病進(jìn)程[24]。有研究提示，PRDM2和JAK/STAT信號(hào)通路在多酚類的抑癌作用中扮演關(guān)鍵的調(diào)控作用[25]。總之，JAK/STAT信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)觀察在體外環(huán)境下miR-153靶向PRDM2在膀胱癌的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-153可以靶向PRDM2調(diào)控膀胱癌的生物學(xué)行為，而且miR-153可能通過(guò)PRDM2的表達(dá)而起到對(duì)PRDM2對(duì)膀胱癌的抑制作用。而后面繼續(xù)通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-153后JAK/STAT信號(hào)通路蛋白水平的變化，顯示miR-153過(guò)表達(dá)后可能通過(guò)降低PRDM2的表達(dá)，下調(diào)p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平，進(jìn)而影響膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

本研究表明miR-153在膀胱癌組織中表達(dá)減低，而PRDM2在膀胱癌組織中表達(dá)明顯增高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-153可以靶向調(diào)控PRDM2的表達(dá)，通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移，提示miR-153和PRDM2可能參與膀胱癌的發(fā)展過(guò)程，有可能成為預(yù)測(cè)膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展的標(biāo)志物。

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