bFGF通過促進心臟血管新生改善心肌梗死后小鼠心臟重構*

沈丹萍， 戈東輝， 陳顯達， 吳雨晴， 李 磊， 褚茂平

(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院， 育英兒童醫(yī)院， 兒童心臟中心， 溫州醫(yī)科大學心臟發(fā)育與轉化醫(yī)學研究所， 浙江 溫州 325027)

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是成纖維生長因子家族的一員，在神經(jīng)系統(tǒng)和心臟中表達豐富，并且具有促進血管生成和細胞增殖遷移等作用[1]。研究表明，外源性bFGF能夠減輕腦損傷患者腦水腫，保護血腦屏障的完整性；同樣，在脊髓損傷患者中，它能夠保證血-脊髓屏障的完整性[2-3]。在心肌缺血再灌注模型中，bFGF能夠通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB，即AKT)信號通路抑制內(nèi)質網(wǎng)應激和過度的自噬反應， 以及清除過多的泛素化蛋白從而來減輕心臟的損傷[4-5]。bFGF也能促進急性心梗時Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，減少心肌凋亡[6]。另有研究表明， bFGF能夠促進內(nèi)皮細胞的有絲分裂和血管新生。Nakamichi等[7]研究發(fā)現(xiàn)了bFGF能夠促進小鼠的皮膚損傷處血管新生。雖然已有幾項研究表明bFGF能夠促進急性心肌缺血區(qū)血管新生，改善左心室功能[8]，但其對于慢性心肌梗死的作用及其深入機制尚未見報道。本研究通過復制小鼠心肌梗死模型，觀察bFGF能否通過AKT通路激活下游的缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白，從而促進心臟梗死區(qū)微血管新生，改善心肌重構和心功能。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級C57/B6小鼠，雄性，8～12周齡，18～20 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，使用許可證號為SYXK(浙)2015-0009。

2 主要試劑

bFGF購自浙江生物技術和制藥工程重點實驗室；Masson染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司；抗p-AKT、 AKT和HIF-1α抗體及HRP標記山羊抗兔IgG購自CST；抗VEGF抗體購自Santa Cruz；抗CD31抗體購自Abcom；ECL 顯色液購自Advansta；異氟烷購自瑞沃德公司；冠狀動脈結扎線購自寧波成和公司；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1小鼠心肌梗死模型的建立 用異氟烷吸入麻醉小鼠，直視下氣管切開，小動物呼吸機輔助呼吸，左側第4 肋間入胸，識別前降支走行范圍，7/0滑線結扎前降支，當左心室前壁部分顏色轉為蒼白，確認小鼠心梗模型成功之后一直維持血管結扎，結扎位置基本相同； 假手術(sham)組用7/0滑線穿過前降支下面而不結扎； bFGF治療組于造模成功7 d后隔天腹腔注射給藥，每只5 μg，直至28 d，總共給藥10次。

3.2超聲心動圖檢測 心梗后7 d及28 d時，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉動物，取仰臥位。使用西門子ACUSON SEQUOIA 512彩色超聲診斷儀檢查小鼠心功能，探頭頻率為12～14 Mz。取左心室乳頭肌水平二維左室短軸切面，記錄左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)及左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)，由超聲心動圖電腦自動計算左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)，取連續(xù)3個心動周期的平均值。

3.3心肌組織Masson染色 實驗小鼠28 d后脫頸椎處死， 立即開胸取心臟，放入PBS中(冰上預冷)，將血液擠干凈，將心室組織做石蠟切片，之后常規(guī)脫蠟入水，蒸餾水沖洗干凈滴入麗春紅液染4 min；再次蒸餾水流水沖洗干凈，滴入磷鉬酸液染2 min；甩干液體后用苯胺藍液染7 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

3.4免疫熒光染色觀察 將上述各組小鼠心臟組織OCT包埋后做冰凍切片，室溫復溫30 min后PBS清洗3次，擦干之后加5% BSA室溫封閉30 min。然后用抗CD31抗體(1∶200)4 °C孵育過夜。用PBS-Tween洗3遍后，用Cy3標記山羊抗兔IgG(1∶500)在37 ℃孵育1 h，PBS-Tween洗4次后，DAPI染色7 min，PBS-Tween洗4次后擦干加抗熒光淬滅劑后封片。熒光顯微鏡下拍照。

3.5Western blot 實驗 小鼠脫頸椎處死后立即開胸取心臟，放入PBS中(冰上預冷)，將血液擠干凈，保留冠脈結扎線以下左室心肌組織， 稱量后放入有裂解液(含蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑)的勻漿管中，勻漿機裂解心肌組織，冰上裂解30 min，離心后超聲3次，每次間隔1 min，12 000×g、4 ℃離心30 min后取上清行BCA法蛋白定量，準備蛋白樣品。用10% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉膜，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，加 I 抗4 ℃孵育過夜，TBS-Tween 洗3 次，加HRP 偶聯(lián) II 抗于室溫孵育2 h，TBS-Tween 洗3 次，加ECL 液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 bFGF改善心肌梗死后心肌纖維化程度

根據(jù)Masson染色結果發(fā)現(xiàn)， 28 d后心肌梗死組心肌組織出現(xiàn)明顯的心肌纖維化，而bFGF給藥組能夠有效減少心肌纖維化程度(P<0.05)，見圖1。

2 bFGF改善心肌梗死后的心功能

超聲心動圖結果顯示，心肌梗死組各項心功能比正常假手術組較差，bFGF組能顯著改善心肌梗死28 d后小鼠心功能，與MI組相比， bFGF組能有效減少左室收縮期末內(nèi)徑(P<0.05)，LVEF和LVFS值明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. Myocardial tissues with Masson staining at 28 d after MI (×400). Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖1心肌梗死28d后心肌組織的Masson染色結果

Figure 2. The results of echocardiography at 28 d after MI. Mean±SD.n=10.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖2心肌梗死28d后的超聲心動圖結果

3 bFGF促進梗死區(qū)組織血管新生

CD31是內(nèi)皮細胞的標志物。本實驗對梗死區(qū)組織中的CD31進行免疫熒光染色來檢測梗死區(qū)微毛細血管的數(shù)量。在高倍鏡下，梗死區(qū)域可見MI組的血管密度比sham組的低，而bFGF給藥組的血管密度比MI組高(P<0.05)，見圖3。

4 bFGF激活心肌AKT/HIF-1α/VEGF信號通路

已有研究報道在血管內(nèi)皮缺氧的情況下，能夠上調(diào)PI3K/AKT/HIF-1α信號通路的活性，從而能夠改善血管內(nèi)皮細胞抗缺氧損傷的作用[9]。因此我們推測bFGF也能夠通過該通路促進梗死區(qū)血管新生，我們檢測了第10天時小鼠心肌中AKT、HIF-1α以及其靶蛋白VEGF的蛋白水平變化。結果發(fā)現(xiàn)第10天時心梗組AKT磷酸化水平比假手術組要高(P<0.05)，但是HIF-1α及VEGF蛋白水平和假手術組比較差異并沒有統(tǒng)計學顯著性；而與心梗組比較，bFGF給藥組的HIF-1α(P<0.05)及VEGF(P<0.05)的蛋白水平更高，心梗28 d后的蛋白變化趨勢跟第10天的蛋白變化趨勢一致，說明bFGF通過隔天腹腔給藥能夠激活AKT/HIF-1α/VEGF通路，見圖4。

Figure 3. Myocardial tissues with CD31 immunofluorescence staining at 28 d after MI (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖3心肌梗死28d后小鼠心肌病理切片的CD31免疫熒光染色

Figure 4. The levels of AKT/HIF-1α/VEGF signaling pathway-related proteins at 10 d and 28 d after MI.Mean±SD.n=3 .#P<0.05vssham group;&P<0.05vsMI group.

圖4心肌梗死第10天及第28天后各組AKT/HIF-1α/VEGF通路相關蛋白水平的變化

討 論

隨著心肌梗死發(fā)病率和致死率的逐年攀升，已成為嚴重威脅全球人民的身體健康。急性期心肌梗死主要的死亡原因是急性心衰竭，隨著醫(yī)療水平的進步，內(nèi)科藥物溶栓、介入支架和外科的搭橋手術使急性期心梗發(fā)展成急性心衰進而導致死亡的幾率大幅度下降。但隨著病情的進一步發(fā)展可轉為慢性期。慢性期主要以心臟纖維化重塑為主，如果纖維重塑過度會引發(fā)慢性心衰導致死亡。然而，到目前為止預防和治療心臟纖維化重塑過度尚無好的方法[10]。

近年來用外源性蛋白因子促進血管新生可能成為一種有效治療心肌缺血的辦法。bFGF在心臟呈高表達，具有較強的促內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖、遷移和分化的作用。研究表明， 心肌內(nèi)注射外源性bFGF，能有效減少梗死面積，促血管新生[11]。但該給藥途徑具有創(chuàng)傷性，因此本研究采用了腹腔隔天注射給藥，對該方法進行了探討。結果發(fā)現(xiàn)隔天腹腔注射給藥也能有效提高小鼠心功能，并且能夠減少心肌纖維化。

持續(xù)表達HIF-1α能夠減少心臟梗死區(qū)域，促進心梗邊緣區(qū)新生血管形成，從而改善心肌重構[12]。心肌缺血雖然能夠促進HIF-1α表達增加，但是這種代償性適應是暫時性的，HIF-1α在心梗后期表達量將趨于正常[13]。在組織缺氧環(huán)境下，作為HIF-1α的靶蛋白， VEGF能特異性作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管形成，從而部分緩解組織缺血[14]。已有研究表明，bFGF在急性心肌梗死后，能夠增加HIF-1α和VEGF的mRNA水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn)bFGF能夠促進梗死邊緣區(qū)血管新生，并深入研究了血管新生的機制，發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組心肌中AKT磷酸化水平、HIF-1α及VEGF蛋白水平明顯比心梗組要高，也說明了bFGF可能通過激活該通路促進梗死邊緣區(qū)血管新生，從而改善心肌纖維化保護心功能。

本實驗的最大局限之處是沒有設立bFGF抑制劑組，在血管新生機制研究方面，發(fā)現(xiàn)bFGF能夠激活AKT/HIF-1α/VEGF通路，但是不能夠說明一定是通過該通路促進梗死邊緣區(qū)的血管新生，或者該通路可能協(xié)同其它通路共同參與血管新生的作用。因此對于bFGF促進心肌梗死邊緣區(qū)血管新生的作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究采用建立小鼠心肌梗死模型，隔天腹腔注射 bFGF，發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組比心梗組的心功能有好轉，心肌纖維化減少，梗死邊緣區(qū)新生血管增多；并且發(fā)現(xiàn)bFGF給藥組能夠提高AKT/HIF-1α/VEGF的蛋白水平，提示bFGF可能通過該通路促進梗死邊緣區(qū)血管新生，保護心臟。

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