基于甲型流感病毒血凝素的廣譜流感疫苗研究進(jìn)展

張靜靜 王 斌 宋路萍 荊新蕊 郭冰峰 馬超援 梁雪爽 馬小偉▲

1.華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南新鄉(xiāng) 453000；2.華蘭基因工程有限公司質(zhì)量控制部，河南新鄉(xiāng) 453500；3.華蘭生物工程股份有限公司血制研發(fā)部，河南新鄉(xiāng) 453000；4.華蘭生物工程股份有限公司總經(jīng)理辦公室，河南新鄉(xiāng) 453000

目前，世界范圍內(nèi)使用的流感病毒疫苗以滅活裂解疫苗和減毒活疫苗為主，其中滅活裂解疫苗被更多的國家批準(zhǔn)使用。但是，由于流感病毒的宿主范圍廣、數(shù)量多、共生情況復(fù)雜，該病毒在進(jìn)化和傳播過程中不斷突變，每年都會(huì)有不同的流行株出現(xiàn)。因?yàn)槊磕甑牧餍兄瓴煌孕枰磕赀M(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、毒株預(yù)測(cè)和篩選、以及相應(yīng)的疫苗生產(chǎn)，其不僅成本高，而且一旦生產(chǎn)不及時(shí)、產(chǎn)量不足或者對(duì)流行株的預(yù)測(cè)不準(zhǔn)確，則不能滿足人群對(duì)即將發(fā)生流感疫情的防御需求。目前預(yù)防流感最有效的措施是接種疫苗，但有2個(gè)因素制約了流感疫苗在防控流感大流行中的應(yīng)用：一是從確定疫苗株到最終獲得疫苗的時(shí)間；二是疫苗株與流行株之間的抗原匹配度。因此，利用甲型流感病毒的保守抗原，研制對(duì)不同亞型間具有交叉保護(hù)作用的廣譜流感疫苗，成為流感疫苗研究的重要內(nèi)容[1-3]。本文對(duì)基于流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）的廣譜流感疫苗研發(fā)進(jìn)展作一綜述。

1 HA的結(jié)構(gòu)和功能

流感病毒基因組由8個(gè)負(fù)鏈的單鏈RNA片段組成。該8個(gè)片段編碼10個(gè)病毒蛋白，其中8個(gè)是病毒粒子的組成成分（HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2 及 PA），另外2個(gè)是分子質(zhì)量最小的RNA片段，編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白—NS1和NS2。HA是構(gòu)成流感病毒包膜纖突的主要成分之一，以三聚體形式存在于包膜表面，是相對(duì)分子質(zhì)量為75 000的典型Ι型糖蛋白，C端在包膜內(nèi)，N端在包膜外。HA由566個(gè)氨基酸組成，其一級(jí)結(jié)構(gòu)具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：信號(hào)肽（前導(dǎo)序列）、胞外域、跨膜域及胞漿域。信號(hào)肽位于HA的氨基端，由16個(gè)疏水性氨基酸組成，在加工過程中被信號(hào)肽酶切除；緊接信號(hào)肽的328個(gè)氨基酸是HA1部分，C端的221個(gè)氨基酸構(gòu)成HA2；在HA1和HA2之間有1個(gè)精氨酸，在加工過程中被切除。經(jīng)過切割產(chǎn)生的HA1和HA2通過1個(gè)二硫鍵連接形成HA單體。HA2主要由疏水性氨基酸組成，可使HA插入病毒包膜的脂質(zhì)雙層。

HA的三維結(jié)構(gòu)是由3個(gè)HA單體通過非共價(jià)連接形成的三聚體，呈頭莖結(jié)構(gòu)，去污劑處理病毒可分離到完整的HA纖突。球狀頭部由部分HA1組成，含有受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇，莖部由HA2和部分HA1組成。HA的頭部主要由β折疊鏈構(gòu)成，莖部主要由2條α-螺旋鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在HA頭部和莖部各單體之間都有局部接觸，使形成的三聚體更加穩(wěn)固。HA單體會(huì)被宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶裂解成HA1和HA2兩個(gè)亞單位，HA1形成球狀頭部結(jié)構(gòu)域，是受體結(jié)合位點(diǎn)和主要中和抗體識(shí)別的抗原決定簇，但具有很高的變異性。而C端HA2莖部錨定在病毒胞膜中，促使病毒胞膜與細(xì)胞膜融合以及病毒核衣殼釋放，含有高度保守的融合序列。根據(jù)HA的抗原性不同，可將甲型流感病毒分為不同的亞型，HA有16個(gè)亞型（H1～H16），不同亞型差異大，所以誘導(dǎo)能針對(duì)不同亞型的廣譜中和抗體是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。

2 基于流感病毒HA廣譜流感疫苗的研究

目前認(rèn)為一些相對(duì)保守的病毒蛋白或者蛋白序列可以誘導(dǎo)出廣譜的免疫反應(yīng)。如血凝素HA2亞基被證實(shí)能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)流感毒株有交叉反應(yīng)的中和抗體，是設(shè)計(jì)通用流感疫苗的熱點(diǎn)。雖然HA在病毒進(jìn)化和傳播過程中不斷突變，但是參與錨定的HA2片段相對(duì)保守，具有誘導(dǎo)廣泛交叉反應(yīng)的抗體潛力，是廣譜流感疫苗的潛在研究目標(biāo)。

已構(gòu)建的含甲型流感病毒HA（全長或片段）抗原的疫苗包括病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）、合成肽、DNA及載體疫苗等。為提高免疫原性和穩(wěn)定性，研究者常將HA（全長或片段）與載體蛋白，如鑰孔戚血藍(lán)素（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、奈外膜蛋白復(fù)合物（outer membrane protein complex，OMPC）融合表達(dá)或化學(xué)偶聯(lián)后制成疫苗。

2.1 VLP疫苗

利用不具有感染性的VLP生產(chǎn)疫苗是疫苗研制中一種應(yīng)用前景較好的方法，并且已經(jīng)在乙型肝炎疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗中獲得成功。VLP的外源表位以有序、陣列方式呈現(xiàn)，可增加抗原的穩(wěn)定性和免疫原性。

利用基因工程方法將H5HA構(gòu)建在pET-28a（+）載體上，肌內(nèi)注射免疫小鼠，然后用H3N2（HK/68）、H1N1（Ca/09）和 HPAI H5N1（Indo/05）流感病毒攻擊小鼠，小鼠可以抵抗病毒的攻擊而存活[4]。

球狀頭部域被不同的連接子取代以產(chǎn)生1個(gè)無頭HA（莖域），然后與流感M1蛋白共表達(dá)，并且鑒定了具有肽（GGGGS）4接頭的莖結(jié)構(gòu)域以穩(wěn)定的方式錨定在細(xì)胞膜上。免疫電子顯微鏡顯示，GGGGS 4接頭穩(wěn)定地整合到流感VLP的表面。用這些VLP免疫的小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)的全身性抗體應(yīng)答，研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)流感病毒的高滴度ADCC抗體，這些VLP也誘導(dǎo)了黏膜免疫反應(yīng)并在鼻和肺洗液中產(chǎn)生抗原特異性IgG和IgA。另外，抗原特異性IgG抗體分泌細(xì)胞（ASC）在脾臟和淋巴結(jié)中顯著增加。該研究的結(jié)果表明，無頭的HA是開發(fā)針對(duì)流感病毒通用疫苗的潛在有效靶點(diǎn)[5]。

2.2 合成肽疫苗

合成多肽疫苗是一種僅含表位組分的多肽，可通過人工方式按照多肽的氨基酸順序合成制備。多肽通常與載體蛋白連接，然后加佐劑制成多肽疫苗。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，流感病毒HA上有幾個(gè)主要的中和表位，可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，如HA92-105、HA127-133、HA183-195、HA317-341。 這些中和表位，都是潛在的開發(fā)通用型流感疫苗研究熱點(diǎn)。

融合肽是公認(rèn)的的高度保守區(qū)域[6，8]，HA2多肽的氨基末端即為融合肽。當(dāng)pH值為中性時(shí)，HA2多肽的第76～126位區(qū)域形成一個(gè)較大的α螺旋結(jié)構(gòu)，第56～75位區(qū)域形成半環(huán)狀結(jié)構(gòu)，第33～55位的23個(gè)氨基酸殘基形成另一個(gè)較小的α螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)pH值降至5.0～6.0時(shí)，HA2多肽的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆性改變，第40～105位區(qū)域形成1個(gè)大的α螺旋結(jié)構(gòu)，并向前推進(jìn)約10 nm，使得原來藏在HA蛋白三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部的融合肽暴露，并靠近細(xì)胞膜。雖然目前對(duì)融合過程的機(jī)制尚不完全明了，但推測(cè)融合肽移位后可插入細(xì)胞膜內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)病毒包膜與胞內(nèi)體膜融合。在大多數(shù)甲型流感病毒高度保守的表位上，融合肽形成了一個(gè)擴(kuò)展的、高度暴露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

在大多數(shù)甲型流感病毒株中，HA2 N端11個(gè)氨基酸序列高度保守。該結(jié)構(gòu)域位于HA前體的一個(gè)凸環(huán)，在受感染宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)。研究針對(duì)融合肽或HA2莖部結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了總結(jié)，兩項(xiàng)研究均表明，免疫含有HA1/HA2結(jié)合區(qū)域合成肽 （或肽偶聯(lián)物）的小鼠在受到病毒攻擊后，死亡率較低[6,9]。

多肽結(jié)合疫苗誘導(dǎo)的抗體在交叉保護(hù)中起著非常重要的作用[10]。更重要的是，廣譜中和抗體反應(yīng)是針對(duì)融合肽或部分該種融合肽，其能夠誘導(dǎo)出的抗體具有中和反應(yīng)和保護(hù)作用，提示其存在著甲型流感病毒類所共有的保守中和表位，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)疫苗的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)有著極其重要的意義[11-12]。采用化學(xué)方法修飾的融合肽免疫，其可以誘導(dǎo)出的抗體反應(yīng)能夠中和甲型流感病毒類并且能夠完全保護(hù)小鼠免受甲型流感病毒致死性的攻毒[7]。因此，進(jìn)一步的研究可基于融合肽開發(fā)通用流感疫苗。

然而，合成多肽疫苗免疫動(dòng)物后所起的免疫保護(hù)作用低于人們的預(yù)期，合成肽疫苗的抗原性和免疫原性受到自身組成及宿主免疫系統(tǒng)等多種因素影響，單一的中和表位遠(yuǎn)不能刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)，可能還需要增加中和抗原表位的數(shù)目，引入抗原表位、佐劑輔助等，因此，如何利用有限的抗原表位來誘導(dǎo)強(qiáng)有力、持續(xù)時(shí)間長的免疫保護(hù)作用需進(jìn)一步深入研究。

2.3 含HA的DNA疫苗和病毒載體疫苗

核酸疫苗是將可表達(dá)保護(hù)性免疫基因的質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，使抗原蛋白經(jīng)過內(nèi)源性表達(dá)并提呈給免疫系統(tǒng)，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫作用。

然而，核酸疫苗的研制和開發(fā)才剛剛起步，還有很多的關(guān)鍵性問題急待解決。第一，所用載體多帶有抗生素基因，導(dǎo)致被免疫機(jī)體可能對(duì)相應(yīng)的抗生素產(chǎn)生抗體，給一些常見細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療帶來困難；第二，目前所研制的核酸疫苗體內(nèi)表達(dá)效率不夠高，免疫保護(hù)力不強(qiáng)，其可能與核酸疫苗在機(jī)體內(nèi)的生存和表達(dá)有關(guān)，有可能進(jìn)入機(jī)體的大部分質(zhì)粒被機(jī)體當(dāng)作異物降解，只有少部分得以殘存和表達(dá)，或者是載體在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)效率不高，降低了核酸疫苗的免疫效果。

流感病毒HA的HA2亞基相對(duì)于HA1球狀頭部結(jié)構(gòu)域非常保守。HA2結(jié)構(gòu)域在不同亞型中有高達(dá)85%的同源序列和在相同亞型之間的毒株有95%的同源性[13]。然而，在自然感染或接種常規(guī)流感疫苗過程中，對(duì)于HA2結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)弱，而且也未見相關(guān)的報(bào)道，可能是由于高免疫原性球狀HA1結(jié)構(gòu)域的存在。

一項(xiàng)研究中使用修飾后的核酸疫苗，用化學(xué)方法把亞病毒顆粒去除HA1結(jié)構(gòu)域免疫兔子或老鼠誘導(dǎo)針對(duì)于HA2的體液反應(yīng)，但在攻毒試驗(yàn)中，沒有提供良好的免疫保護(hù)作用[14]。然而，最近的研究表明，成功的疫苗設(shè)計(jì)誘導(dǎo)HA2免疫，具有球狀頭部結(jié)構(gòu)域的HA分子在流感病毒攻毒實(shí)驗(yàn)中提供良好的免疫保護(hù)作用[15]。也有相似的研究報(bào)道，識(shí)別在中間的莖部結(jié)構(gòu)域HA構(gòu)象表位的單克隆抗體（C179），可以中和所有的H1和H2亞型[15]。另有報(bào)道稱，其他單克隆抗體結(jié)合的HA莖部結(jié)構(gòu)域經(jīng)過分離和鑒定，具有廣泛交叉反應(yīng)性中和活性[16-20]。這樣一個(gè)廣泛的中和抗體結(jié)構(gòu)和功能分析表明，其可以通過插入到重鏈，到1個(gè)在莖區(qū)的保守部位以阻止感染，從而在病毒進(jìn)入的過程中，可能阻止膜融合，因此，單克隆抗體能夠中和多種亞型的流感病毒[10,12]。

最近的研究表明，用重組疫苗接種和/或轉(zhuǎn)基因修飾的免疫原可以產(chǎn)生針對(duì)于保守表位抗體的疫苗。用質(zhì)粒DNA和重組腺病毒載體疫苗，經(jīng)初免-加強(qiáng)疫苗接種表達(dá)H1，HA誘導(dǎo)抗體識(shí)別保守莖部結(jié)構(gòu)域，因此具有廣泛的中和活性。用DNA和VLP疫苗的3劑疫苗免疫小鼠提高了流感病毒多個(gè)亞型的交叉反應(yīng)性抗體，該種疫苗含有修飾缺乏的球狀頭域HA分子，但保持完整的莖部結(jié)構(gòu)域，包括HA1和HA2的部分區(qū)域[21]。

具有廣泛中和活性的H3亞型單克隆抗體（12D1）可以識(shí)別HA2蛋白的α螺旋區(qū)域，HA2蛋白對(duì)應(yīng)的氨基酸為76-106[22]。基于12D1抗體的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含氨基酸76-130 HA2的合成肽，偶聯(lián)到KLH載體蛋白，然后產(chǎn)生抗流感病毒HA蛋白莖部結(jié)構(gòu)域的抗體[22]。該種疫苗對(duì)病毒抗原性不同的亞型有保護(hù)作用[21]。綜上所述，上述研究提供了有力的證據(jù)，支持基于相對(duì)保守的HA莖部結(jié)構(gòu)域，開發(fā)具有廣泛保護(hù)作用廣譜流感疫苗的有效途徑。

3 小結(jié)

在過去幾十年中，流感疫苗獲得較快的發(fā)展，從最初的全病毒滅活疫苗到現(xiàn)在的病毒裂解疫苗、亞單位疫苗，進(jìn)一步保證了疫苗的安全性。隨著新技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)流感病毒研究的深入，廣譜或通用流感疫苗的研究為“一勞永逸”而非頻繁更換生產(chǎn)用毒株來生產(chǎn)流感疫苗帶來了希望。

目前廣譜流感疫苗的研究目標(biāo)主要集中在流感病毒M2蛋白高度保守的胞外結(jié)構(gòu)域或NP、M1和HA蛋白的保守抗原表位，并且已在研究中獲得了很好的動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)，其均為開發(fā)具有誘導(dǎo)廣泛交叉保護(hù)疫苗的發(fā)展提供了有力證據(jù)。美國佐治亞大學(xué)與法國賽諾菲巴斯德公司合作，開發(fā)出了一種基于HA對(duì)多種毒株的甲型H1N1流感病毒都具有防護(hù)作用的流感疫苗。COBRA流感疫苗設(shè)計(jì)為可識(shí)別出過去100年內(nèi)曾分離出的所有H1N1型流感病毒毒株。實(shí)驗(yàn)中疫苗還對(duì)H1N1流感病毒以外的其他類型流感病毒產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，目前正處于臨床前研究階段。葛蘭素史克基于嵌合HA蛋白的通用流感疫苗進(jìn)入臨床 1 期試驗(yàn)[23-24]。 Multimeric-001（M-001）是以色列的Biond Vax公司開發(fā)的一種候選通用流感疫苗，該疫苗最初是由以色列魏茲曼科學(xué)研究所、以色列科學(xué)與人文科學(xué)學(xué)院前院長Ruth Arnon教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)，主要是將來自于流感病毒HA、NP與M蛋白的9個(gè)保守線性表位串聯(lián)后通過大腸桿菌系統(tǒng)融合表達(dá)后純化制備，并將在2018/19流感季之前正式開展其候選通用流感疫苗M-001的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，該疫苗是第1個(gè)挺進(jìn)Ⅲ期臨床試驗(yàn)的通用流感疫苗[25-27]。但是否真的可以通過1次或多次“廣譜流感疫苗”的免疫，使人體獲得對(duì)流感病毒株的廣譜有效保護(hù)，還需更多的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證和支持。