對動物檢疫中檢測試劑使用問題的探討

李曉琳，吳紹強，景宏麗，王 勤，劉曉飛，仇松寅，林祥梅

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 100176）

進(jìn)出境動物檢疫工作直接關(guān)系到國門安全，而敏感、特異的檢測試劑是確保檢疫任務(wù)順利完成的前提。因此對常用檢測試劑進(jìn)行對比，充分了解其各參數(shù)指標(biāo)，以便在實際工作中加以選擇應(yīng)用就顯得格外重要。

目前檢測試劑的對比已廣泛應(yīng)用到多個領(lǐng)域，如Balmaseda等[1]對4種寨卡病毒ELISA檢測試劑盒和2種RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行了比對，F(xiàn)elin等[2]對4種弓形蟲抗體ELISA與凝集試驗進(jìn)行了比較，F(xiàn)loras等[3]對一種犬類降鈣素原（Procalcitonin，PCT）（敗血癥的生物標(biāo)志物）商品化試劑盒進(jìn)行了驗證，Palle-Reisch等[4]對兩種商品化芥菜ELISA試劑盒和3種自主研發(fā)的實時PCR方法進(jìn)行了比較。

本文通過近幾年我國動物檢疫常用試劑的比對，梳理了其在使用過程中遇到的問題，并在此基礎(chǔ)上提出了相應(yīng)的解決措施，以期為我國進(jìn)出境動物檢疫試劑的選用提供技術(shù)支撐。

1 存在的問題

1.1 檢測靶標(biāo)不同導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)差異

隨著市場需求的增多，同一種疫病的同一種檢測方法在市場上會出現(xiàn)多個不同品牌的試劑。ELISA試劑盒因包被抗原不同，PCR方法因針對基因不同均可導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)差異。同時不同國家或地區(qū)生產(chǎn)的試劑盒大部分更適用于本國或地區(qū)，當(dāng)檢測其他國家或地區(qū)的樣品時，結(jié)果也會出現(xiàn)一定差異。

王勤等[5]利用“兩步法”對4種市售豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV） 抗 體 ELISA檢測試劑盒進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其中2種試劑盒為通用型試劑盒，即能夠同時檢測歐洲型和美洲型PRRSV，另外2種為美洲型試劑盒，僅能夠檢測美洲型病毒抗體，當(dāng)樣品中含有歐洲型病毒抗體時，則不能被檢測出。

史茜等[6]針對非免疫無口蹄疫豬血清、免疫3次以上的健康豬血清、免疫感染和非免疫人工感染的豬血清共計4個群體的樣本，比較了4個廠商的口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA試劑盒。結(jié)果顯示，4種試劑盒針對不同群體的診斷敏感性為76.8%～94.4%，診斷特異性為97.7%～100%。

Lane等[7]對包拉米蟲的10個混合樣品，運用針對actin 1和18S rRNA的兩種熒光PCR方法進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)針對actin 1基因的方法未出現(xiàn)陽性結(jié)果，而針對18S rRNA基因的方法能成功檢測出5個陽性樣品。季新成等[8]利用來自澳大利亞的牛血清（41份）、新西蘭的牛血清（40份）、烏拉圭的牛血清（30份）和我國新疆的牛血清（46份），對Svanova、IDEXX和VMRD生產(chǎn)的3種ELISA試劑盒進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果因樣品來源的不同而有所差異。

1.2 檢測方法不同導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)差異

為了對疫病進(jìn)行更準(zhǔn)確檢測，針對同一種疫病往往使用多種檢測技術(shù)，而不同檢測方法常導(dǎo)致結(jié)果差異。副結(jié)核病常用的檢測方法包括遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（Delayed type hypersensitivity，DTH）和ELISA法等。2013年，新疆出入境檢驗檢疫局采用DTH和ELSIA法先后對兩批共計2 106只澳大利亞進(jìn)境種羊進(jìn)行了副結(jié)核病檢測：用DTH對第1批1 344只羊進(jìn)行檢測，檢出陽性69只，而應(yīng)用ELSIA方法檢出陽性1只；應(yīng)用DTH對第2批762只羊進(jìn)行檢測，檢出陽性68只，而應(yīng)用ELSIA方法檢出陽性2只。這表明DHT和ELISA方法的檢測結(jié)果差異較大。目前國際貿(mào)易中常用的布魯氏菌病檢測方法有虎紅平板凝集（RBT）、血清凝集試驗（試管法，SAT）、補體結(jié)合（CFT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。

王玉玲等[9]利用321份樣本，對RBT、SAT、CFT、iELISA、cELISA和熒光偏振試驗（FPA）進(jìn)行了比對。將cELISA作為參考標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)RBT、SAT更適用于布魯氏菌病的早期診斷；CFT的敏感性明顯低于iELISA、FPA、cELISA，但特異性和陽性預(yù)測值都相對較高。

高 洪 霞[10]等 通 過 RBT、SAT、HVRI-cELISA、IDEXX-iELISA和Svanova-cELISA方法，對牛羊布魯氏菌疫苗免疫后的血清抗體進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)IDEXX-iELISA與其他方法的結(jié)果差異較大，HVRI-cELISA與Svanova-cELISA的符合率較高。

趙祥平等[11]利用3 998份烏拉圭進(jìn)口奶牛，通過比較ELISA、AGID和PCR方法檢測牛白血病的檢出率和符合率發(fā)現(xiàn)：ELISA的檢出率最高，PCR最低；AGID與ELISA的符合率為78%，而PCR與ELISA和AGID的符合率分別為43%和55%，符合性較差。

季新成[12]對新疆15個地區(qū)的635份牛血清，采用SYNBIOTICS公司的ELISA試劑盒進(jìn)行了牛傳染性鼻氣管炎病毒血清抗體檢測，對其中的35份又用病毒中和實驗（VN）進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)同為陽性的24份，同為陰性的7份，兩者符合率為88.6%。

1.3 檢測試劑性能不同導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)差異

實際工作中，某些檢測試劑的特異性不高，易與同種屬的其他疫病發(fā)生非特異性反應(yīng)，造成檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，影響檢疫把關(guān)的準(zhǔn)確性。施馬倫貝格病是2011年夏季在德國首次發(fā)現(xiàn)的一種蟲媒性病毒病，在歐洲的大部分國家均有發(fā)生[13]。因其病原與赤羽病病原均屬于布尼亞病毒科正布尼亞病毒屬辛波血清群，基因序列存在一定的同源性，在實際工作中，檢測這兩種疫病的試劑常無法將兩者完全區(qū)分出來，存在一定的非特異性反應(yīng)。

肖雷等[14]對1 150份樣品進(jìn)行了藍(lán)舌病抗體檢測，在AGID檢測中，因藍(lán)舌病病毒與EHDV、Ibaraki病毒有共同的群特異性抗原，導(dǎo)致在檢測過程中出現(xiàn)非特異性沉淀反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

王玉玲等[15]用3 955份種牛血清樣品，對PANAFTOSA實驗室的口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA（簡稱間接ELISA）進(jìn)行了評價，運用酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗（Enzyme-linked immunotransfer blot，EITB）、iELISA、RT-PCR方法進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)此試劑盒的假陽性率較高，特異性較差。

在實際工作中，某些檢測試劑的敏感性低，易造成漏檢現(xiàn)象發(fā)生，導(dǎo)致患病動物進(jìn)入國內(nèi)，對我國的疫病安全造成威脅。

肖妍等[16]通過微量血清中和試驗，驗證了690份澳大利亞純種荷斯坦奶牛血清，對兩種赤羽病ELISA試劑盒進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)日本某公司生產(chǎn)的赤羽病ELISA試劑盒診斷敏感性僅為39.47%。

王玉玲等[17]利用34份背景清晰的牛血清樣本，對4種市售副結(jié)核病ELISA試劑盒進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)僅1種試劑盒獲得了滿意的結(jié)果，其余3種試劑盒的檢測結(jié)果均存在一定問題。

吳華偉[18]等利用57份標(biāo)準(zhǔn)血清，對5個國內(nèi)廠家生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）抗體檢測試劑盒進(jìn)行了測定，同時比較了試劑盒間的符合率，發(fā)現(xiàn)5種試劑盒的診斷敏感性差異較大，位于57.7%～100%之間，且各試劑盒間檢測結(jié)果的符合率僅為63.2%，表明僅2個試劑盒適用于PCV2抗體檢測。

2 解決措施

動物檢疫常用試劑質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠。目前，市售試劑盒的質(zhì)量參差不齊，如何在紛繁復(fù)雜的市場中快速挑選出適用于檢疫工作需求的檢測試劑，建議采取如下措施：

2.1 建立標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的質(zhì)量評價體系

世界大部分國家和地區(qū)均建立了符合自己國情的動物檢測試劑質(zhì)量控制體系，并指定專門機構(gòu)對試劑進(jìn)行評價和準(zhǔn)入。近年來，受原國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局動植物監(jiān)管司委托，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院陸續(xù)開展了牛流行性腹瀉/粘膜病等6種常用動物疫病檢疫試劑質(zhì)量評價工作，以分析敏感性、診斷敏感性、診斷特異性、批內(nèi)和批間變異系數(shù)等作為試劑盒評價指標(biāo)，以樣品盤代表性、試驗室檢測資質(zhì)等作為實驗室評價指標(biāo)，通過對試劑供應(yīng)商、評價實驗室開展“雙招標(biāo)”，確保了評價結(jié)果的科學(xué)、客觀、公正。但由于此工作尚處于起步階段，在今后的工作中應(yīng)不斷吸取經(jīng)驗教訓(xùn)，逐步建立起標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的評價體系。

2.2 依據(jù)檢測目的選擇相應(yīng)試劑，多種方法配套使用

疫病的檢測方法雖然種類繁多，但沒有一種方法適合所有的個體或群體流行病學(xué)調(diào)查，對個體進(jìn)行篩查時所有的方法均存在一定局限性。在實際工作中，可以根據(jù)不同的檢測目的，選取相應(yīng)的檢測試劑。如：當(dāng)應(yīng)用于疫病的篩查、流行病學(xué)調(diào)查等工作時，應(yīng)選擇診斷敏感性高的“廣譜”檢測試劑，提高檢出率；針對臨床發(fā)病病例、疑似疫病的確診時，則應(yīng)選擇診斷特異性較高的檢測試劑，確保檢測結(jié)果的可靠性；將兩者有機結(jié)合，如在一線口岸初篩工作中可首先選用診斷敏感性高的檢測試劑，防止“漏檢”，確?？诎栋踩瑢梢申栃詷悠吩俨捎迷\斷特異性高的檢測試劑進(jìn)行復(fù)核驗證，保障檢測結(jié)果經(jīng)得起歷史檢驗。同時，可依據(jù)世界動物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中推薦的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對樣品的狀態(tài)進(jìn)行最終的確認(rèn)，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性。

2.3 加強自主研發(fā)，提高檢測水平

當(dāng)前工作中使用的試劑，往往因生產(chǎn)國家或地區(qū)的不同，導(dǎo)致同一樣品的判定結(jié)果出現(xiàn)差異。一方面，試劑盒本身的質(zhì)量存在差異；另一方面，由于指標(biāo)優(yōu)化等環(huán)節(jié)采用的是國外動物的血清等臨床樣品，因此臨床樣品的背景值與我國本土品種亦可能存在差異。應(yīng)借助科研院所、產(chǎn)業(yè)化機構(gòu)的力量，聯(lián)合研發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測試劑，防止檢測試劑“水土不服”。與此同時，我國應(yīng)加大對檢測人員能力的培訓(xùn)，不斷提升檢測水平，最大限度的降低因人員操作造成的結(jié)果差異。

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