針刺內關穴預處理改善心肌缺血再灌注損傷機制的研究進展

母曉藝，宋艷華 ，張 蒂 ，孫佳琳 ，譚奇紋△

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

近年來，隨著生活水平的提高，缺血性心肌病發(fā)病率逐漸上升，危害著人類的健康。臨床心肺復蘇、溶栓治療、心臟外科體外循環(huán)、心臟移植等方法的應用使缺血的心肌組織能夠得到及時的再灌注，但有時再灌注反而會進一步加重組織損傷，導致組織和器官的功能障礙，稱為缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注后氧自由基生成增多，細胞內Ca2+超載，并引發(fā)炎癥反應，這些因素都會直接或間接造成心肌細胞損害。大量臨床及動物實驗研究證實內關穴具有特異性治療心系疾病的特征，針刺內關穴預處理可以改善機體內環(huán)境，減輕病理損害。本研究對針刺內關穴預處理治療心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)的機制研究進行相關文獻的綜述。

1 減少自由基

心肌缺血再灌注發(fā)生時，由于缺氧、應激、細胞損害等原因自由基生成過多，超出機體抗氧化防御系統(tǒng)的代償能力，細胞的各種成分如膜磷脂、蛋白質、核酸等可與自由基發(fā)生反應，破壞細胞結構從而影響細胞正常生理功能。在早期，自由基與細胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，引起膜脂質微環(huán)境的紊亂，其產物丙二醇(Malonaldehyde, MDA)可增加細胞膜通透性，引發(fā)Ca2+內流，加重細胞損害。Zhang等[1]發(fā)現(xiàn)針刺內關穴預處理可以有效激活氧自由基清除系統(tǒng)，增加過氧化物分解酶——谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的含量，減輕心肌細胞膜脂質過氧化反應，減少過氧化產物MDA，起到保護心肌細胞的作用。Nrf2-ARE信號通路是激活抗氧化酶的關鍵通路。自由基含量增多時,氧化劑刺激Nrf2蛋白從胞漿穩(wěn)定體中解離，進入細胞核。其與ARE結合激活通路并作用于下游相關抗氧化酶基因，從而增強機體抗氧化能力。邵明璐等[2]發(fā)現(xiàn)內關穴預處理后血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性升高，Nrf2及HO-1基因表達上調，心肌細胞損害減輕；針刺內關穴可上調Nrf2-ARE信號通路，從而帶動下游抗氧化酶的表達以提升氧自由基清除能力，起到保護心肌的作用。

2 減輕炎癥損害

炎癥反應在心肌缺血再灌注過程中扮演了重要的角色。缺血再灌注發(fā)生期間，白細胞(主要是中性粒細胞)明顯增加，其浸潤數(shù)目越多，對心肌組織造成的損害越嚴重[3]。激活的中性粒細胞可釋放大量的致炎物質，造成自身及血管內皮細胞的損傷。針刺內關穴可通過多種細胞信號途徑，抑制趨化因子和黏附因子的釋放，減少白細胞聚集，同時調節(jié)血管活性物質的釋放，保護微血管，具體作用如下。

2.1 減少白細胞聚集

缺血再灌注期間，細胞黏附分子和炎性因子如血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等生成增多[4]，誘導白細胞粘附于血管內皮，白細胞與血管內皮細胞之間相互作用，造成細胞損害和微循環(huán)障礙。胡惠林等[5]發(fā)現(xiàn)針刺內關穴預處理可以明顯降低炎癥相關蛋白TNF-α、VCAM-1、核轉錄因子NF-κB(NF-κB)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，控制炎癥反應。邵忠華等[6]研究發(fā)現(xiàn)電針內關穴可以通過降低高遷移率族蛋白1( high mobility group box 1,HMGB1)的表達，減輕心肌組織內炎性細胞的浸潤。HMGB1是一種重要的“晚期”炎性細胞因子，不僅能促使TNF-α、IL-1等促炎因子的表達，還能激活MAPK信號通路促使核轉錄因子NF-κB發(fā)生核移位[7]，NF-κB的激活能夠活化炎性細胞因子[8]，因此抑制HMGB1蛋白的表達能夠減輕炎癥反應。同時，錢鋼等[9]的實驗進一步證實針刺內關穴對HMGB1蛋白的抑制作用與JAK/STAT通路的激活密切相關。

2.2 保護微血管

再灌注期間縮血管物質大量釋放，舒張血管的物質合成受到抑制，引起微血管循環(huán)障礙并可能引發(fā)無復流現(xiàn)象。王雙昆等[10]的動物實驗證實，大鼠發(fā)生心肌缺血再灌注損傷后，具有強大的收縮血管及誘導血小板聚集作用的血漿內皮素(ET)、血栓素(TXB2)含量升高；具有舒張血管及抗血小板聚集作用的6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)相對減少。針刺內關可調節(jié)以上的血管活性物質，改善微血管舒縮，增加心肌血氧供應。同時實驗還發(fā)現(xiàn)不同頻率電針對血管活性物質的調節(jié)作用不完全相同；NO具有舒張血管的功能，采用高頻電針預處理內關穴，相較低頻電針，血清NO升高更為明顯，而ET、TXB2及6-keto-PGF1α的變化無明顯差異。降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)具有強大的血管擴張作用[11]，再灌注時其過量的釋放會引起血管的過度擴張，加重心肌的再灌注損傷。林亞平等[12]發(fā)現(xiàn)，電針內關穴預處理可有效降低再灌注后血漿內CGRP的含量，使其維持在一個相對較高的濃度，發(fā)揮舒張血管的有利作用，且高頻電針作用下CGRP下降更為明顯，其維持的濃度更有利于心肌細胞的保護，減輕MIRI。

3 減輕細胞內鈣超載

缺血再灌注時，細胞Na+-Ca2+交換異常，Ca2+內流增加及內質網中Ca2+的釋放導致鈣超載。鈣超載不僅加重細胞結構的損害，還可引起心肌纖維過度收縮，引發(fā)再灌注性心律失常。針刺內關穴預處理可有效降低缺血心肌細胞內鈣離子濃度，減輕鈣超載[13]袁葉等[14]證實針刺內關穴可明顯提高血清鈣網蛋白(Calreticulin,CRT)的含量，促進CRT表達的上調，從而抑制腎小管上皮細胞內質網中Ca2+的釋放，減輕鈣超載[15],保護心肌細胞。田岳鳳等[16]進一步從基因角度證實針刺內關穴可提高CRTmRNA的表達率，幫助維持細胞內Ca2+穩(wěn)定。CaMKⅡ是一種Ca2調節(jié)酶，鈣超載時其活性增強。CaMKⅡ可作用于肌漿網上的不同受體，控制肌漿網內鈣離子的釋放與吸收，減輕細胞內鈣超載并恢復心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)[17]。針刺內關穴可調節(jié)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表達，減輕鈣超載，同時對心肌細胞其到良好的保護作用[18]。

4 抑制細胞凋亡

心肌缺血再灌注期間內環(huán)境的改變促進了細胞凋亡的發(fā)生，這種病理上的變化會進一步加重MIRI。影響凋亡進程的相關基因中Bcl-2有抑制細胞凋亡的作用，其同源水溶性蛋白Bax是人體重要的凋亡基因，針刺內關穴預處理可提高Bcl-2的表達水平，同時抑制Bax，擴大Bcl-2/Bax的比值以減少凋亡，保護心肌細胞[19]。其作用途徑主要是通過切斷外源性信號傳遞、抑制內質網應激、保護線粒體結構等影響介導凋亡的因子。在外源性信號傳導過程中Fas蛋白與Fas配體(Fas-L)結合將凋亡信號導入細胞內，引起凋亡蛋白酶、限制性內切核酸酶的活化以裂解細胞蛋白，降解DNA片段并最終導致細胞死亡[20]。林海波等[21]證實針刺內關穴預處理可抑制Fas/Fas-L蛋白的表達，減少細胞凋亡，且具有48 h的延遲相保護效應，可為臨床針刺介入時間提供初步實驗依據。線粒體是介導細胞凋亡的重要細胞器。缺血再灌注時，由于內環(huán)境的改變，線粒體通透性轉換孔(MPTP)持續(xù)開放、線粒體膜電位降低、磷脂膜結構破壞使促凋亡分子如細胞色素C釋放到胞質，經一系列酶促反應激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase,凋亡蛋白)，最終導致細胞凋亡[22]。MPTP在線粒體介導細胞凋亡中扮演著重要的角色，再灌注時期細胞內Ca2+超載、自由基聚集等因素會導致MPTP的開放，馮果等[23]實驗研究發(fā)現(xiàn)電針預處理內關穴可激活心肌細胞膜上的蛋白激酶C(PKC)，PKC啟動ATP敏感性鉀通道(KATP)，K+外流增加進而抑制Ca2+內流，在減輕胞內Ca2+超載同時抑制MTPTP的開放，減輕細胞凋亡。針刺內關穴預處理在再灌注時期提高SOD的活性、減輕自由基在心肌組織中的聚集的作用對線粒體有良性的保護作用，實驗證實針刺后線粒體水腫減輕，線粒體膜電位上升并趨于穩(wěn)定，MPTP開放減少，從而減少心肌細胞的凋亡和壞死，對心肌產生保護作用[24,25]。缺血再灌注時細胞中內質網合成、加工蛋白質的功能受到影響，內質網內錯誤折疊蛋白增多，觸發(fā)未折疊蛋白反應(Unfolded protein response,UPR)[26]以分解錯誤蛋白，如果內質網內錯誤蛋白積累過多，超出細胞代償能力，將引發(fā)內質網應激(ERS)。Caspase-12、CHOP蛋白介導的細胞凋亡均與ERS密切相關。翟昌林等[27]發(fā)現(xiàn)電針內關預處理可以抑制ERS，減少心肌細胞caspase-12、CHOP蛋白的表達，抑制細胞凋亡。

5 調節(jié)細胞自噬

細胞自噬是真核細胞的一種程序性保護機制，在溶酶體酶的作用下降解錯誤蛋白、受損細胞器并對其成分進行再循環(huán)利用以維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，自噬作用過多或過少會導致細胞死亡。Beclin 1基因是調控細胞自噬的關鍵基因，心肌缺血、缺氧時Beclin 1基因表達無明顯變化而再灌注時期其表達顯著升高，抑制這種過度表達可降低心肌細胞的死亡率[28]。此外Beclin 1基因與抗凋亡基因bcl-2可互相影響彼此介導的細胞活動，Beclin 1突然升高造成的失衡會加速細胞死亡[29]。譚成富等[30]發(fā)現(xiàn)，針刺內關穴預處理可降低Beclin 1的表達，調節(jié)再灌注時期的細胞自噬活動，平衡其與凋亡間的反饋作用，達到心肌保護作用。

6 誘導保護性蛋白增加

熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是細胞在接收應激刺激后，誘導產生的一種保護蛋白。再灌注時期，HSP可從穩(wěn)定細胞內變性蛋白質、干擾應激所啟動的細胞調亡程序、減輕細胞離子紊亂等方面穩(wěn)定細胞內環(huán)境，維持細胞功能，避免MIRI的發(fā)生[31]。譚成富等[32]觀察針刺內關穴預處理對HSP家族中最主要的三類蛋白：HSP90、HSP70、HSP27的影響，發(fā)現(xiàn)HSP70在針刺后即刻便出現(xiàn)表達增強，并于針刺后48 h內處于高表達狀態(tài)；HSP27的變化較晚，在針后24～48 h內表達增強；而HSP90受針刺影響較小，在各時間段其含量無明顯變化。HSP含量的變化說明針刺對MIRI的保護效應具有時間差異，并具有延遲相保護作用。

7 維護心肌細胞縫隙連接

縫隙連接(Gap junction,GJ)是細胞間進行直接信息交流的細胞內通道，可迅速將細胞內的信息通過電信號或化學遞質傳遞給相鄰細胞?？p隙連接蛋白(Connexin,Cx)是GJ通道的基本結構和功能蛋白，在心室肌細胞內Cx主要由Cx43構成。周丹等[33]實驗發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注時GJ分布稀疏、扭曲，Cx43表達下降。電針預處理內關穴后GJ結構完整性得到保護，Cx43表達量提升。說明針刺內關穴預處理通過參提升心肌細胞Cx43表達，參與缺血再灌注心肌細胞的保護。Cx43有兩種不同的狀態(tài)，即磷酸化和去磷酸化，Cx43只有在磷酸化狀態(tài)下才具有功能活性。實驗發(fā)現(xiàn)心肌缺血會引發(fā)Cx去磷酸化且Cx43總量不變[34]，這種磷酸化的改變會減弱細胞間的耦合，引起嚴重的心律失常[35]。Gao等[36]研究發(fā)現(xiàn)電針內關預處理可顯著減少去磷酸化的Cx43的含量，從而改善受損的GJ,減少再灌注期間心律失常的發(fā)生。

8 調控細胞色素P450代謝通路

花生四烯酸細胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)是體內參與多種內源性和外源性化合物代謝的一系列酶系，可代謝花生四烯酸?；ㄉ南┧?Arachidonic acid,AA)經CYP450代謝途徑可產生環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)及20-羥-二十烷四烯酸(20-HETE)。EETs具有強大的心血管效應，具有抗炎、擴血管、溶纖、抗凋亡和促血管生成作用[37-38]而20-HETE在再灌注期間會造成心肌組織蛋白過氧化損傷，加重MIRI[39]。代謝花生四烯酸產生EET的CYP亞家族以CYP2C和CYP2J為主[40]，生成HETEs的主要是CYP4家族，主要是CYP4A和CYP4F。李洋等[41]運用基因芯片技術分析內關穴調節(jié)MIRI作用的潛在通路和靶基因。結果表明電針內關穴預處理可上調CYP2家族基因，促進EETs生成同時下調CYP1和CYP4家族基因，抑制內源性20-HETE生成，調節(jié)細胞代謝減輕MIRI。

9 討論

內關善治心胸諸疾，早在《靈樞·經脈》篇中提到：“心系實則心痛，虛則為頭強，取之兩筋間也。”后世有《百癥賦》“建里內關，掃盡胸中之苦悶”和《標幽賦》“胸腹?jié)M痛刺內關”的經驗總結。中醫(yī)“治未病”思想倡導“未病先防，既病防變”，內關穴對心肌的保護作用在心肌缺血再灌注損傷的防治中有很大的應用前景，實驗證實在心肌組織發(fā)生病理改變前針刺內關穴即可減少缺血再灌注對心肌組織的損害，臨床中，可以采用這種簡單的干預手段，在缺血期及溶栓治療前針刺內關穴以心肌起到良性保護作用。目前其作用機制研究雖深入到分子生物學水平，但多為研究單一蛋白或基因的表達對細胞信號途徑或細胞內環(huán)境的影響，尚未形成完整的理論體系，對作用主次及先后還缺乏細致的研究。隨著基因芯片技術的應用，能夠實現(xiàn)同一時間對數(shù)以萬計的基因進行大規(guī)模平行檢測與分析，從而實現(xiàn)對內關穴調節(jié)作用進行多系統(tǒng)、多靶點分析，在未來的實驗研究中有廣泛的應用前景，其作用機制的清晰和完善將為其在重大疾病的應用提供更完善的理論支持和新的治療思路。