土家藥紅黑二丸的研究進(jìn)展△

楊德泉

(湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南　吉首　416000)

紅黑二丸，又名紅白二丸、巖丸子、鴛鴦七、山海棠，為秋海棠科植物中華秋海棠Begonia grandis Dry subsp. sinensis (A. DC.) Irmsch的塊莖，是一種常用的土家族民間藥材。土家醫(yī)藥理論認(rèn)為，紅黑二丸性微冷，味酸、辣。具有趕火止瀉，活血療傷，止血等功效。土家醫(yī)臨床用于熱瀉癥、心口痛、跌打傷痛、血熱出血、痢疾、淋濁、白濁、毒蛇咬傷等病癥[1,2]。中醫(yī)藥理論認(rèn)為，紅黑二丸性微寒、味甘苦，具有活血化瘀，止血涼血，消腫解毒的功效。適用于吐血、咳血、咯血、崩漏、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、痢疾、白帶等[3]。近年來，一些學(xué)者對(duì)紅黑二丸的顯微鑒別、化學(xué)成分、藥理作等方面進(jìn)行了的研究，現(xiàn)綜述如下。

1　生藥鑒定

葉叢進(jìn)等[4]報(bào)道了對(duì)紅黑二丸藥材的生藥鑒定研究。紅黑二丸的性狀為：塊莖呈扁圓球或不規(guī)則塊狀，直徑0.7～3cm。表面棕紅色至黑褐色，有不規(guī)則的皺紋。上端凹窩狀，偶有葉柄殘留基，下方常殘留須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，不易折斷，斷面類白色或淡紅棕色，粉性，散在微小的亮星。氣微，味微苦。

根莖的橫切面結(jié)構(gòu)特征為：木栓細(xì)胞4～6層列，切向延長，表面觀長方形或多角形。木栓細(xì)胞外側(cè)有時(shí)可見表皮細(xì)胞，表皮細(xì)胞外側(cè)附有角質(zhì)層，表皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)常有受擠壓的薄壁細(xì)胞。木栓層內(nèi)為薄壁細(xì)胞區(qū)，其內(nèi)散生給你管束，維管束中導(dǎo)管束明顯。皮層、中柱和髓部無明顯分界。薄壁細(xì)胞中含淀粉粒，有的含有簇晶或集合成簇的細(xì)小晶群。研究認(rèn)為，以上特征可作為中華秋海棠根莖鑒別的依據(jù)。

鄭麗慧等[5]基于ITS2序列建立紅白二丸藥材及其近緣易混品的分子鑒定方法。方法是收集67份紅白二丸藥材(中華秋海棠)及其近緣易混品(秋海棠、掌裂葉秋海棠和柔毛秋海棠)，提取總DNA、PCR擴(kuò)增ITS2序列并進(jìn)行雙向測序，通過CodonCode Aligner V4.2.1對(duì)測序序列進(jìn)行質(zhì)量分析和拼接，采用MEGA 6.0進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并基于最近距離法和建樹法(NJ樹和UPGMA樹)對(duì)紅白二丸藥材及其近緣易混品進(jìn)行物種鑒定。結(jié)果：最近距離法和建樹法的結(jié)果均表明，中華秋海棠與其近緣易混品掌裂葉秋海棠、柔毛秋海棠能有效區(qū)分，但其與秋海棠未能區(qū)分開(秋海棠與中華秋海棠為原亞種與亞種的關(guān)系)。結(jié)論：ITS2序列可以有效區(qū)分紅白二丸藥材及其近緣易混品的物種基原，可以作為紅白二丸藥材的分子鑒定方法，為紅白二丸藥材的真?zhèn)舞b別和保證臨床用藥安全提供有效的技術(shù)支持。

2　化學(xué)成分

李丹平[6]采用紫外、紅外、高效液相及氣質(zhì)-聯(lián)用對(duì)提取得到的紅黑二丸中的甾醇類物質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果是，分離純化后的植物甾醇都表現(xiàn)出了甾醇的特征峰，而且干擾較少，分離純化效果較好；GC-MS結(jié)果顯示，紅黑二丸中的甾醇類物質(zhì)有四種：β-谷甾醇(含量43.42%)、豆甾醇(含量11.68%)、豆甾-5，24(28)-雙烯-3β-醇(含量11.23%)、麥角甾-5-烯-3β-醇(含量9.13%)。

涂志超[7]對(duì)不同采收期、不同產(chǎn)地的紅黑二丸，采用溶劑法提取分離，回收各有效部位溶劑，得到正丁醇、乙酸乙酯提取物。利用LC-MS的方法建立了紅黑二丸正丁醇、乙酸乙酯提取物的指紋圖譜，同時(shí)鑒定了紅黑二丸正丁醇提取物中9種黃酮苷類成分，分別為：槲皮素-3-O-鼠李糖-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖-葡萄糖-木糖苷阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖-葡萄糖-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖-葡萄糖-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖-鼠李糖-鼠李糖苷、皂草苷；乙酸乙酯提取物中7種黃酮類成分，其中6種成分是首次從紅黑二丸中鑒定得到，分別是：表兒茶酸、表兒茶醛、原花青素b1、原花青素b2、表兒茶素、兒茶素。4種成分是首次從秋海棠屬藥用植物中鑒定得到，分別是：原兒茶醛、兒茶素、原花青素b1、原花青素b2。

3　提取工藝

李丹平[6]研究了紅黑二丸中甾醇類物質(zhì)的提取工藝。采取溶劑結(jié)晶法、超聲波法及超臨界CO2萃取法等三種方法比較了提甾醇類物質(zhì)的效果，結(jié)果以超聲波法提取率最高，為84.4%(含量為0.76mg/g)。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了紅黑二丸中的甾醇類物質(zhì)的提取工藝，結(jié)果最佳提取條件為藥液比1：24，提取溫度為55，提取時(shí)間為5min，提取得到的紅黑二丸中的甾醇含量為1.78mg/g；并采用HPLC對(duì)紅黑二丸中的甾醇類物質(zhì)進(jìn)行了分析。以吸附率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化了硅膠吸附紅黑二丸中甾醇類物質(zhì)的最佳工藝。最佳吸附時(shí)間2.5h，吸附溫度35℃，吸附液濃度為0.4mg/mL，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯=10:1，紅黑二丸中甾醇類物質(zhì)的吸附率為87.54%。

高麗等[8]報(bào)道，使用超聲波提取法對(duì)中華秋海棠進(jìn)行提取，利用改進(jìn)的Liebermarn - Bur chard比色法對(duì)秋海棠根莖超聲波提取物中的甾醇進(jìn)行定量分析，研究了料液比、溫度、時(shí)間和提取溶劑4個(gè)因素對(duì)秋海棠根莖中甾醇含量的影響，選取提取溫度、提取時(shí)間和料液比為影響因子，采用3元2次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)，對(duì)超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，計(jì)算回歸方程，并進(jìn)行響應(yīng)面分析，同時(shí)采用高效液相色譜法分析其甾醇種類，結(jié)果甾醇提取的最佳工藝條件為：提取溫度58℃，提取時(shí)間57 min，料液比1:44(g/mL)；在此條件下，中華秋海棠中甾醇含量為1.80 mg/g。高效液相色譜分析顯示，中華秋海棠含有β-谷甾醇及其他種類甾醇。認(rèn)為超聲波輔助提取法能提高提取效率，是一種節(jié)能、省時(shí)的好方法，作為中華秋海棠根β-谷甾醇提取的新工藝，具有良好的應(yīng)用前景。

4　含量測定

涂志超[7,9]建立了測定紅黑二丸及其非藥用部位莖、葉中5種黃酮和酚酸類成分(原兒茶酸、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素和蘆丁)含量的UPLC分析方法。采用acquityuplchsst3色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，以甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脫，流速0.2ml·min-1，檢測波長280nm，柱溫30℃。結(jié)果表明所有樣品5個(gè)成分均達(dá)到基線分離，線性關(guān)系良好，原兒茶酸、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、蘆丁的加樣回收率分別為：99.45%、96.92%、99.69%、98.42%、99.75%(rsd均小于5%)。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，能較好的反映紅黑二丸的質(zhì)量情況，為紅黑二丸的后續(xù)開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

高麗等[8]采用比色法和高效液相色譜法對(duì)中華秋海棠提取物中的甾醇類化合物進(jìn)行了定量分析，液相法測得中華秋海棠提取液中β-谷甾醇的得率為1.05mg/mL，比比色法測得的總甾醇含量小，說明中華秋海棠中還可能含有其他甾醇化合物。

蔣佳雯等[10]采用液相法，測定中華秋海棠地下部分的蘆丁含量為0.034%。吳家紅等[11]采用液相法測定中華秋海棠地下部分的β-谷甾醇含量為0.11%。

5　藥理作用

5.1防治高血脂和動(dòng)肪硬化李丹平[6]研究證實(shí)，紅黑二丸甾醇類物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠高血脂癥和動(dòng)脈硬化具有較好的預(yù)防和治療作用。

5.2治療慢性盆腔炎涂志超[7]報(bào)道了對(duì)紅黑二丸治療慢性盆腔炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。利用抑制LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)分泌炎性介導(dǎo)因子的抗炎作用模型，研究紅黑二丸不同提取物的抗炎作用。通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)篩選藥物實(shí)驗(yàn)濃度，利用炎性刺激物大腸桿菌型LPS刺激細(xì)胞，檢測受試物抑制細(xì)胞分泌炎性介導(dǎo)因子TNF-α、IL-1β及NO的作用。結(jié)果表明：經(jīng)LPS誘導(dǎo)的炎癥模型組TNF-α、IL-1β及NO含量顯著升高，紅黑二丸乙醇提取物及乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物能顯著抑制TNF-α、IL-1β及NO的生成與釋放。由此可初步推斷紅黑二丸乙醇提取物及乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物具有一定的抗炎作用，作用機(jī)理與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子TNF-α、IL-1β及NO有關(guān)。通過研究紅黑二丸正丁醇、乙酸乙酯提取物對(duì)慢性盆腔炎模型大鼠的影響，探討其作用效果及初步機(jī)理。將Wistar大鼠除假手術(shù)組(只手術(shù)不造模)外，其余大鼠建立慢性盆腔炎模型(機(jī)械損傷加混合菌感染)，造模7d后，隨機(jī)分為模型組、紅黑二丸正丁醇提取物高和低劑量組、紅黑二丸乙酸乙酯提取物高和低劑量組、陽性對(duì)照組，共7組，每組動(dòng)物8只，連續(xù)給藥14d后(假手術(shù)及模型組同法灌胃蒸餾水)，分別進(jìn)行子宮腫脹度檢測、子宮病理組織學(xué)檢查及血清il-2、il-6水平測定。結(jié)果表明紅黑二丸正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物均能明顯抑制子宮腫脹、改善子宮炎癥程度、促進(jìn)炎癥大鼠Il-2、Il-6水平恢復(fù)至正常水平。結(jié)果表明紅黑二丸能有效地減輕大鼠子宮炎癥，其作用機(jī)理與抑制炎性因子有關(guān)。

5.3促凝血徐元翠等[12]報(bào)道，取小鼠和大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和紅黑二丸組，紅黑二丸組灌胃給于紅黑二丸提取物1 mL/100 g bw，對(duì)照組灌胃給于等體積生理鹽水，qd，連續(xù)給藥7 d后，分別測定小鼠出血時(shí)間(BT)、血凝血時(shí)間(CT)、大鼠的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)、全血漿凝塊溶解時(shí)間及血小板數(shù)(PLT)。結(jié)果：與對(duì)照組相比，紅黑二丸提取物能明顯縮短BT，降低CT、APTT和PT。同時(shí)，紅黑二丸提取物能使全血漿凝塊溶解時(shí)間延長、血小板數(shù)增高。證明紅黑二丸具有明顯的促凝血作用。

5.4活血化瘀習(xí)忻等[13]采用直接給藥的試驗(yàn)方法，在給藥后30min、60min、90min等不同時(shí)間，用WX-9型微循環(huán)顯微鏡觀察小鼠耳廓微細(xì)動(dòng)、靜脈口徑、毛細(xì)血管交叉網(wǎng)開放數(shù)量等指標(biāo)的變化。結(jié)果：紅黑二丸能明顯增大正常小鼠耳廓微細(xì)動(dòng)、靜脈口徑，增加毛細(xì)血管開放數(shù)目，改善微循環(huán)(P<0.01)。證實(shí)紅黑二丸具有顯著改善小鼠耳廓微循環(huán)作用，為該藥活血化瘀作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5.5抗炎鎮(zhèn)痛姚勇等[14]采用急性和慢性呼吸道炎癥模型探索紅黑二丸甾醇提取物的抗炎作用和靶點(diǎn)。利用昆明小鼠吸入香煙煙霧，制作急性肺損傷模型，用不同濃度的紅黑二丸甾醇提取物處理，HE染色檢測肺組織病理學(xué)變化，Elisa檢測TNF-α，MPO的變化，Western blotting檢測cPLA2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，制造急性肺損傷模型后，小鼠肺葉片狀變實(shí)，肺泡腔廣泛縮小或消失，肺泡間隔增厚，大片炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁的毛細(xì)血管充血，TNF-α，MPO，cPLA2的表達(dá)增加，給藥后少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡膈明顯，肺泡壁的毛細(xì)血管充血狀態(tài)明顯減輕，TNF-α，MPO的分泌減少，同時(shí)cPLA2的表達(dá)降低(P<0.05)。利用卵白蛋白(OVA)誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生支氣管哮喘制作呼吸道慢性炎癥模型，用不同濃度梯度的紅黑二丸甾醇提取物處理，HE染色檢測病理學(xué)變化，Elisa檢測IL-4，IL-5，IL-13的變化，Western blotting檢測cPLA2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，制作支氣管哮喘模型后，肺部血管和支氣管周圍大量炎細(xì)胞滲出，支氣管杯狀細(xì)胞大量增生，IL-4，IL-5，IL-13，cPLA2的表達(dá)增加，給藥后，炎細(xì)胞減少，杯狀細(xì)胞增生減少，IL-4，IL-5，IL-13的分泌減少，cPLA2的表達(dá)降低(P<0.05)。以上急慢性呼吸道炎癥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅黑二丸甾醇類提取物量效依賴地通過抑制cPLA2抗呼吸道炎癥。

王世華等[15]采用二甲苯造成小鼠耳廓腫脹、大鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)觀察紅黑二丸提取物的抗炎作用；通過小鼠甲醛致痛實(shí)驗(yàn)觀察其鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果：紅黑二丸提取物能夠較明顯抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹，抑制大鼠棉球肉芽腫的增重，減少小鼠在注射甲醛后0～5 min，15～30min兩個(gè)時(shí)相內(nèi)舔足時(shí)間、減輕甲醛所致小鼠足跖腫脹。結(jié)果顯示紅黑二丸提取物具有較明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用。

5.6抗心肌損傷姚勇等[16]報(bào)道， western blot檢測不同H/R時(shí)間點(diǎn)iPLA2蛋白的表達(dá)，確定H/R的時(shí)間點(diǎn)；在H/R的基礎(chǔ)上，用不同濃度梯度的紅黑二丸甾醇提取物處理細(xì)胞，western blot檢測iPLA2蛋白表達(dá)，MTT法檢測細(xì)胞存活率，試劑盒檢測LDH、SOD、MDA、TNF-α的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡。結(jié)果：H60min/R30min，iPLA2蛋白表達(dá)最高(P<0.01)，紅黑二丸甾醇提取物量效依賴地降低了其蛋白表達(dá)，同時(shí)降低H/R時(shí)LDH、MDA、TNF-α的含量，減少凋亡，提高SOD的活性及細(xì)胞的存活率(P<0.05)。結(jié)論：紅黑二丸甾醇提取物能通過iPLA2量效依賴地抗心肌細(xì)胞H/R損傷。

5.7止瀉丁家森等[17]報(bào)道，將72只小鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、大黃煎液陽性對(duì)照組、復(fù)方高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組、蒙脫石散組.小鼠給予灌胃大黃煎液，構(gòu)建急性腹瀉模型，再分別給予高、中、低劑量復(fù)方煎液和蒙脫石散溶液，觀察比較各組小鼠腹瀉指數(shù)。結(jié)果：復(fù)方各劑量組腹瀉指數(shù)明顯低于大黃煎液陽性對(duì)照組(P<0.05)，中劑量組效果最為明顯。結(jié)果顯示紅蜈蚣七和巖丸子復(fù)方水煎液均有較好的止瀉作用。

5.8其它作用李丹平[6]采用測定POV值的方法研究β-谷甾醇、微膠囊化-谷甾醇及VE在豬油中的抗氧化效果，結(jié)果，微膠囊化β-谷甾醇具有較強(qiáng)的抗豬油油脂氧化能力，其抗氧化效果優(yōu)于β-谷甾醇和VE；甾醇抗氧化交果呈劑量效應(yīng)，劑量越大，其抗氧化效果越明顯。紅黑二丸甾醇類物質(zhì)對(duì)供試的金色葡萄球菌、枯草芽桿菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌及志賀氏菌均有一定的抑菌效果，且都隨著甾醇濃度提高，抑菌作用越明顯。紅黑二丸甾醇類物質(zhì)對(duì)霉菌具有一定的抑菌效果，且對(duì)黑曲霉和橘青霉抑制效果相當(dāng)。

6　資源與栽培

趙寶林等[18]對(duì)北京周邊山區(qū)進(jìn)行的資源調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有野生的中華秋海棠，通過調(diào)查和定點(diǎn)觀察、試驗(yàn)，了解北京地區(qū)中華秋海棠的資源分布與形態(tài)特征、及其栽培特性、生物學(xué)特性的基本情況，并進(jìn)行引種栽培研究。