蒙藥十三味紅花秘訣丸對AR大鼠脾臟中IL-2、IL-4細胞因子蛋白表達的影響△

尤曉苗　李　林*　李小薇，2　劉毅毅　袁　旭　王　馨　劉添洋

(1.內蒙古自治區(qū)醫(yī)科大學，內蒙古　呼和浩特　010010；　2.天津中醫(yī)藥大學，天津　300000)

過敏性鼻炎又叫變應性鼻炎(allergic rhinitis ,AR)，是人體接觸過敏原后，有很多種免疫活性細胞和細胞因子共同作用，鼻黏膜對外界的過敏原發(fā)生反應，繼而出現了以組織損傷和功能紊亂為代表的I型變態(tài)反應[1]，其主要癥狀是鼻塞、鼻癢、打噴嚏、流鼻涕，有的患者伴有眼睛癢，耳朵癢等自感癥狀。發(fā)病人數劇增，病人非常痛苦，病情發(fā)展可加重為過敏性哮喘，直到過敏性休克，最后死亡，對該病的治療至今還沒有特別有效的方法[2]。蒙醫(yī)藥在治療過敏性鼻炎方面有豐富的治療經驗，很多蒙醫(yī)藥的方藥和治法都深受廣大群眾的信任。蒙醫(yī)藥治療過敏性鼻炎以清血、希拉熱、燥黃水消粘、解毒為治療原則。

Th1 與 Th2免疫反應失去平衡引發(fā)的異常免疫反應是過敏性鼻炎最為常見的致病機制，脾臟中有豐富的淋巴細胞，其中含有豐富的抗原遞呈細胞和CD4+T輔助細胞(Th)[3]。本實驗通過觀察蒙藥十三味紅花秘訣丸對AR大鼠脾臟中Th1細胞產生的IL-2細胞因子和Th2細胞產生的IL-4細胞因子在蛋白層面的表達的影響，來研究該藥治療過敏性鼻炎的相關機制。

1　實驗材料

1.1實驗動物選用健康wistar大鼠60只，由中國人民解放軍軍事科學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK-(軍)2012-0004。大鼠養(yǎng)于內蒙古醫(yī)科大學金山校區(qū)中醫(yī)學院實驗動物房，早晨進食，自由飲水，隔日更換墊料，以保持清潔，適應性喂養(yǎng)1周后進行正式試驗。

1.2實驗藥品十三味紅花密訣丸(蒙藥名稱：敖必德森古日古木-13)，內蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室，生產批號20130912；千柏鼻炎片，修正藥業(yè)集團，生產批號140406。

1.3主要實驗試卵清蛋白(OVA)，SIGMA公司，生產批號CA24141806；氫氧化鋁[Al(OH)3]，d津市風船化學試劑科技有限公司，生產批號20151023；伊文思藍，北京百靈威科技有限公司，生產批號LM70O28；Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，生產批號20160720；SDS-PAGE Loading Buffer，北京索萊寶科技有限公司，生產批號P1015；組織蛋白抽提試劑盒，江蘇康為世紀生物科技有限公司，生產批號CW0560S；Thermo預染蛋白marker，江蘇康為世紀生物科技有限公司，生產批號CW0021S；Pro-Light HRP化學發(fā)光檢測試劑，江蘇康為世紀生物科技有限公司，生產批號CW0049M；Anti-IL2抗體，艾博抗(上海)貿易有限公司，生產批號ab92381；Anti-IL4抗體，艾博抗(上海)貿易有限公司，生產批號ab9622。

1.4主要實驗設備儀器中藥粉碎機，型號LX-08B；液氮罐,美國 Thermo forma 公司;高壓滅菌鍋,日本Panasohic MLS-3781L-PC;微量移液槍，美國Rainin PiPet-Lite 各種型號；離心機，德國Eppendorf Centrifuge 5424 R；凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD Universal Hood II；微型渦旋混合儀，上海青浦瀘西儀器 XW-80A ；37℃恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣 DHP-9052；雙板垂直電泳儀，北京六一儀器公司 DYCZ-24K/S 型；轉印電泳儀，北京六一儀器公司 DYCZ-40K型；電泳儀電源，北京六一儀器公司 DYY-6E型。

2　實驗方法

2.1實驗分組將60只wistar大鼠隨機分成6組，分別是空白組對照組，模型組對照組，千柏鼻炎片組，蒙藥高劑量組，蒙藥中劑量組，蒙藥低劑量組，每組10只。

2.2過敏性鼻炎大鼠模型的建立全身基礎致敏：除空白對照組外，其他各組大鼠用腹腔注射予卵清蛋白的方法建立過敏性鼻炎模型。用卵清蛋白0.3mg，30mg氫氧化鋁粉末溶于1mL生理鹽水中配制成混懸液，每兩d進行1次腹腔注射，空白組對照組用30mg氫氧化鋁粉末溶于1mL生理鹽水，混勻后進行腹腔注射，共14d，共注射7次。

鼻部強化激發(fā)：從造模第15d開始，造模組用稀釋成10%的卵清蛋白溶液和生理鹽水制成混合液點滴大鼠雙側鼻孔，每側滴加20 μL，每d分上下午2次進行刺激，一共進行7次，空白對照組用等量的生理鹽水進行滴鼻攻擊。

2.3模型評價主觀評價：在造模完成以后，通過觀察模型大鼠的行為30min，標記大鼠抓鼻子、打噴嚏的次數、鼻涕流出的范圍，把所得的分數加在一起，行為學評分大于5分來證明造模成功。計分標準見表1。

客觀評價：PCA被動皮膚過敏原實驗(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)，即在造模結束后，空白組大鼠用0.1mL生理鹽水皮內注射作為陰性對照，其他造模組大鼠皮內注射lmg卵清蛋白和0.1mL的1%伊文斯蘭溶液配制成的混合液，觀察30min，把注射部位的皮膚硬結和染料擴散情況進行測量記錄，進行皮下PCA檢測[4]，當直徑<5mm記為陰性，直徑>5mm記為陽性。如果皮下PCA反應是陽性結果就可以說明大鼠體內已經產生OVA特異性抗體，也同時說明了過敏性鼻炎的動物模型造模成功[5]。

2.4給藥干預造模成功后，每組給予相應藥物進行干預，根據人鼠藥物劑量換算[6]：d鼠= d人×70kg×0.018/0.2kg，為標準體重動物人與大鼠藥物劑量換算公式。計算后：蒙藥高劑量組為1100mg/kg，蒙藥中劑量組為550mg/kg，蒙藥低劑量組為275mg/kg，千柏鼻炎片組為409mg/kg，其余兩組均給予等量生理鹽水，1次/d，治療期為28d。

2.5實驗操作治療結束后，用10%水合氯醛(0.3m L/100g)腹腔注射進行麻醉，刺激大鼠眼瞼無反射后，將大鼠仰臥位固定,剪開腹腔，從腹主動脈抽取血液將大鼠處死。大鼠死亡后，取大鼠脾臟組織，用蛋白抽提試劑盒提取蛋白樣品，配膠后按順序進行上樣電泳、轉模、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影，最后得到蛋白灰度條帶，用Image J軟件用顯色后的條帶掃出蛋白灰度值，用目的因子的蛋白灰度值比上內參因子的蛋白灰度值，得出目的因子灰度值的計算值，用于下一步的統(tǒng)計分析。

2.6統(tǒng)計學方法用spss22.0進行統(tǒng)計分析，資料服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析法，各組之間樣本均數的比較用 LSD 檢驗。

3　結果

在大鼠鼻腔末次激發(fā)后，對每只大鼠觀察30min，如表2所示，空白組大鼠總行為學積分均少于5分，而造模組大鼠總行為學積分均超過5分，造模組大鼠的癥狀積分與空白組大鼠相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，主觀表明過敏性鼻炎大鼠造模初步成功。在給藥28d結束后，再次對大鼠行為學評估，每只仍觀察30min記錄評分，空白對照組大鼠較前沒有明顯變化，評分小于5分；模型組大鼠較前變化不明顯，評分均超過5分；其余治療組大鼠各種鼻部癥狀較前減輕。如表3所示，經組間比較發(fā)現各治療組與模型對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其余各組兩兩比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。最后一次造模結束后，隨機選取空白組大鼠10只和造模組大鼠10只,進行PCA被動皮膚過敏原實驗。空白組大鼠背部直徑<5mm，結果全部為陰性，造模組有8只大鼠直徑都為10mm，大于5mm,另外兩只大鼠直徑小于10mm但亦大于5mm,大鼠陽性反應居多，證明大鼠體內有OVA抗體,客觀表明基礎造模成功。

如圖1、表4、表5所示，模型組(生理鹽水組)與空白對照組相比，模型組大鼠脾臟組織的IL-2細胞因子蛋白表達明顯降低(P<0.05)。蒙藥十三味紅花秘訣丸高、中、低劑量組和千柏鼻炎片組與模型組相比，各治療組IL-2細胞因子的蛋白表達均有不同程度的回升，其中蒙藥高劑量組和千柏鼻炎片組回升幅度較明顯(P<0.05)；蒙藥中劑量組和蒙藥低劑量組也有所回升(P>0.05)。蒙藥各劑量組與千柏鼻炎片組相比較，蒙藥高劑量組回升幅度大于千柏鼻炎片，千柏鼻炎片組回升幅度大于蒙藥中、低劑量組(P<0.05)。

如下圖2、表6、表7所示：模型組(生理鹽水組)大鼠與空白組相比較，模型組大鼠脾臟組織中的IL-6細胞因子蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。蒙藥各劑量組和千柏鼻炎片組與模型組相比，各治療組IL-6細胞因子蛋白的表達均有不同幅度的下降，蒙藥高劑量組、千柏鼻炎片組回降幅度較大(P<0.05)；蒙藥中劑量組回降幅度較小(P>0.05)；蒙藥低劑量組回降幅度最小(P<0.05)。蒙藥各治療組與千柏鼻炎片組相比較，蒙藥高劑量組回降幅度大于千柏鼻炎片組，千柏鼻炎片組回降幅度高于蒙藥中低劑量組(P>0.05)。

總體來說，蒙藥十三味紅花秘訣丸有糾正Th1/Th2失衡的作用。

表2　各組大鼠造模后鼻部癥狀計分比較(±s，n=6)

表2　各組大鼠造模后鼻部癥狀計分比較(±s，n=6)

組別n癥狀積分空白組61.833±0.75模型組66.83±0.75▼蒙藥高劑量組66.83 ±0.75▼蒙藥中劑量組67.17±1.17▼蒙藥低劑量組67.17±0.75▼千柏鼻炎片組67.00±0.89▼

注：與空白對照組比較，▼P<0.05。

表3　各組大鼠用藥后鼻部癥狀計分比較(±s，n=6)

注：與模型對照組比較，#P<0.05。

表4　Western-Blot檢測IL-2細胞因子的蛋白表達灰度計算值

高劑量組中劑量組低劑量組千柏鼻炎片組生理鹽水組空白對照組IL-2114604.2873299.0968802.2398160.9356792.33123549.71ACTIN140586.34141311.25141288.92143011.25142432.12141846.15IL-2/ACTIN0.8150.5190.4870.6860.3980.871

表5　各組間IL-2細胞因子蛋白的相對表達量的比較(±s，n=3)

注：與空白組比較，*P<0.05； 與模型組比較，#P<0.05； 與高劑量組比較，▽P<0.05； 與低劑量組比，▼P<0.05。

表6　Western-Blot檢測IL-4細胞因子的蛋白表達灰度計算值

高劑量組中劑量組低劑量組千柏鼻炎片組生理鹽水組空白對照組IL-433967.7660665.1585434.0737976.22139807.1321264.19ACTIN145724.23144823.44145113.62144098.61144028.17145890.01IL-4/ACTIN0.2330.4180.5880.2630.970.145

表7　各組間IL-4細胞因子蛋白的相對表達量的比較(±s，n=3)

注：與空白組比較，*P<0.05； 與模型組比較，#P<0.05； 與高劑量組比較，▽P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05；與低劑量組比，▼P<0.05。

討論

白介素2(IL-2)在T細胞增殖中具有重要作用，能有效促進 T淋巴細胞和NK細胞的增生，促進B細胞分化生成抗體。[7]IL-2不僅可以提升免疫反應，還可以維持Treg細胞介導的免疫耐受，故具有雙向免疫調節(jié)作用[8]。IL-2在體內擴增可以增強淋巴細胞功能，有相關研究報道IL-2還可以抑制腫瘤生長[9]。IL-4是Ⅱ型輔助T細胞分泌的細胞因子，人類白細胞介素-4受體(IL-4)屬于紅細胞生成素受體超家族成員，存在于B細胞、T細胞、胸腺細胞和巨噬細胞等細胞表面上，與IL-4特異性結合后發(fā)揮其生物學功能[10]。IL-4增加，促進巨噬細胞提呈抗原，增強殺傷腫瘤細胞的功能，表明Th2參與的體液免疫增強[11]。本實驗選取了IL-2和IL-4細胞因子來對比蒙藥十三味紅花秘訣丸干預前后過敏性鼻炎在蛋白層面的表達的變化。

從實驗結果顯示來看，模型組大鼠脾臟組織中IL-2細胞因子在蛋白層面的表達明顯的低于空白對照組，說明過敏性鼻炎的發(fā)生過程中，Th1細胞產生的IL-2細胞因子的蛋白表達會出現明顯的下降。各治療組與模型組相比，IL-2細胞因子蛋白的表達都出現了一定程度的升高，說明所用干預藥物蒙藥十三味紅花秘訣丸和千柏鼻炎片能夠提高IL-2細胞因子的表達，也間接地說明對過敏性鼻炎都有一定的治療效果，各治療組之間比較時我們發(fā)現，在提高IL-2蛋白表達方面，千柏鼻炎片與蒙藥高劑量組提高的幅度更大，且蒙藥高劑量組高于千柏鼻炎片組，兩組都明顯高于蒙藥中、低劑量組，說明蒙藥高劑量組治療過敏性鼻炎藥效最好，千柏鼻炎片組其次，且都比蒙藥中、低劑量組療效好。

模型組大鼠與空白對照組大鼠相比，IL-4細胞因子蛋白的表達明顯的升高，說明過敏性鼻炎的發(fā)病過程中，IL-4細胞因子的表達會升高。各治療組與模型組對比，IL-4細胞因子蛋白表達均有不同程度的降低，說明干預藥物蒙藥十三味紅花秘訣丸和千柏鼻炎片都有降低IL-4因子表達的作用，其中，蒙藥高劑量組降低最為明顯，千柏鼻炎片組其次，蒙藥中、低劑量組稍有降低，說明，蒙藥高劑量和千柏鼻炎片均可降低IL-4因子蛋白的表達，蒙藥高劑量組效果最好，也同時說明蒙藥高劑量組治療過敏性鼻炎效果最好且比千柏鼻炎片組和蒙藥中、低劑量組效果好。

綜上所述，過敏性鼻炎會引起Th1細胞產生的IL-2細胞因子的降低，引起Th2細胞產生的IL-4細胞因子的升高，引起Th1/Th2失衡。用藥干預后，在IL-2和IL-4細胞因子蛋白層面的表達水平方面，蒙藥十三味紅花秘訣丸有糾正Th1/Th2失衡的作用，其中蒙藥高劑量組回升和回降幅度最大，從整個實驗來看，蒙藥中劑量組和蒙藥低劑量組對相關細胞因子的調控也有一定的作用，但作用很小，整體來說蒙藥高劑量組效果最好。