精氨酰-tRNA合成酶基因研究進展

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(內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014010)

基因表達的成功完成是由mRNA合成蛋白質(zhì)時有效準確的翻譯過程所決定的，這個過程是由核糖體催化的。 mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)的保真度和遺傳信息表達的準確性高度依賴于氨酰基tRNA合成酶(aaRS)對氨基酸t(yī)RNA的特異性附著。精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)是第一類氨酰tRNA合成酶中較為特殊的一種，且多數(shù)不同來源的 ArgRS 缺乏保守的 KMSK 序列。ArgRS在蛋白質(zhì)生物合成過程中發(fā)揮著重要功能，它催化tRNA氨酰化過程的高度專一性，是遺傳信息能夠從mRNA精確地傳遞到蛋白質(zhì)的重要原因。它的3個作用物是ATP、L-arginineh和tRNA(Arg)，它的3個產(chǎn)物是AMP、二磷酸和L-Arginyl-tRNA[1]。這種酶屬于連接酶家族，特殊之處在于它在氨酰tRNA和相關(guān)化合物中形成碳氧化合物。它的系統(tǒng)命名是L-精氨酸：tRNA精氨酸連接酶(AMP-形成)，其他廣泛的名字有：精氨酰tRNA合成酶、精氨酰轉(zhuǎn)移核糖核苷酸合成酶，精氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶，精氨酰轉(zhuǎn)移核糖核酸酶，精氨酰tRNA合成酶和精氨酸t(yī)RNA合成酶。它參與精氨酸和脯氨酸的新陳代謝和氨酰生物合成。此外，在它的N末端含有一段叫作精氨酰tRNA合成酶N終止區(qū)域或者額外區(qū)1(ADD-1)的保守區(qū)域，這段區(qū)域大約含140個氨基酸殘基，而且有研究表明它參與tRNA的識別。一般認為氨酰tRNA合成酶催化反應(yīng)按兩步反應(yīng)進行[2]:

1) 氨基酸+ATP→ AMP-氨基酸+PPi

2) AMP-氨基酸+tRNA→氨基酞-Trna+AMP

精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)的特殊之處是：它所催化的氨基酰化反應(yīng)是由tRNA的參與一步進行的。ArgRS 對 L-Arg 的識別結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由法國 Cavarelli 等以酵母ArgRS 與 L-Arg 形成的共晶所闡明的[3]。

1 不同生物體的精氨酰tRNA合成酶

1.1 微生物精氨酰tRNA合成酶

以大腸桿菌為例，大腸桿菌精氨酰tRNA合成酶是第一類氨酰tRNA合成酶，是一種由577個氨基酸殘基組成、分子量為64.8 KD的單鏈酶，在大腸桿菌氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)中ArgRS與谷氨酰胺酰tRNA合成酶和谷氨酰tRNA合成酶具有獨特性質(zhì)，即都需要相應(yīng)的tRNA才能進行它所催化的第一步氨基酸活化反應(yīng)；在它的一級結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)現(xiàn)KMSKS這個第一類aaRS的特征序列。目前對其研究較多的還是其結(jié)構(gòu)和序列。針對其在大腸桿菌中的含量少的限制因素，黃意巍等[5]在ri-ani G.等克隆的高表達基因的基礎(chǔ)上優(yōu)化了表達條件，進一步使該基因表達提高，提高了550倍，為以后的研究打下基礎(chǔ)。伍金富等[4]也通過對大腸桿菌精氨酰tRNA合成酶基因定點突變重組，重組過程中ArgRS第二位氨基酸殘基由天冬酰胺變?yōu)樘於彼?，產(chǎn)生了變種酶，利用該酶在體內(nèi)積累的時間相對較短的特性，降低了其被宿主蛋白水解酶的水解，進而減少對宿主菌的毒性作用，達到利于分離、純化變種酶的目的，證實了進一步研究ArgRS的結(jié)構(gòu)和功能的可用ArgRS 2 ND代替ArgRS。大腸桿菌的三級結(jié)構(gòu)表明，其精氨酸結(jié)合位點對精氨酸的類似物刀豆酸有較好的結(jié)合能力[6]。

1.2 植物精氨酰tRNA合成酶

目前酵母和大腸桿菌的精氨酸系統(tǒng)的研究已經(jīng)完成。 然而，高等真核生物的酶的信息是有限的，并且植物氨酰基tRNA合成酶在這方面已經(jīng)很大程度地被忽略。在植物中，蛋白質(zhì)合成發(fā)生在3個不同細胞間隔：細胞質(zhì)，線粒體和葉綠體。所有氨酰-tRNA合成酶的編碼都在核基因組中，并且在擬南芥中已經(jīng)顯示有雙重靶向發(fā)生[7]。就植物精氨酰tRNA合成酶而言，苔蘚、小立碗蘚，具有單一的精氨酰tRNA合成酶基因，其產(chǎn)物包括85個氨基酸的前導(dǎo)物。在植物中，精氨酰-tRNA合成酶和脯氨酰-tRNA合成酶是僅有的兩種特殊的酶，他們的細胞器靶向性是由密切相關(guān)的胞質(zhì)酶通過推定的基因復(fù)制過程，然后獲取信號結(jié)構(gòu)[8]。因此，在催化過程中，單一的精氨酰-tRNA合成酶不僅必須識別核編碼的同源tRNA，而且還必須認識到原核生物體編碼的tRNA，并且在一些植物中必須識別不同的線粒體編碼的tRNAArg異構(gòu)體。目前，在植物中，除了其與對應(yīng)tRNA的個性元件互相作用的研究外，關(guān)于植物氨酰tRNA合成酶的酶學(xué)結(jié)構(gòu)的詳細知識仍然匱乏。

1.3 動物精氨酰tRNA合成酶

作為AARS之一的精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)由大鼠中的Rars基因編碼。研究表明，在大鼠的動脈閉塞(MCAO)模型中可以觀察到ArgRS表達水平的升高[9]。在哺乳動物細胞內(nèi)有兩種形式的胞質(zhì)精氨酰-tRNA 合成酶 ArgRS，一種與氨基酰-tRNA 合成酶(aaRS)復(fù)合物的形成有關(guān)，另外一種是游離形式的 ArgRS ，命名為 ΔNArgRS，參與復(fù)合物形成的 ArgRS 命名為 cArgRS，且在其 N 端有 72 個氨基酸的延伸肽段是多余的, 且N-端 72 個氨基酸殘基對酶的催化活性沒有貢獻。研究表明，復(fù)合物對于細胞的存活和分化不是必需的[9]。同時研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制精氨酰-tRNA合成酶基因的表達也可增加動物對缺氧缺血海景的耐受[10]。

2 精氨酰tRNA合成酶基因表達的遺傳調(diào)控研究

2.1 啟動子特異性

精氨酰tRNA合成酶基因的調(diào)控是從啟動子開始的。啟動子是RNApol和基本轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域，他們共同組裝成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物，其中一些基因家族成員的表達是器官特異性的，有一些缺乏特異性[11]。因為基因的特異性轉(zhuǎn)錄是由酶與啟動子是否能有效地形成二元復(fù)合物所決定，故轉(zhuǎn)錄起始過程中的首要問題是RNA聚合酶如何有效地找到啟動子并與之結(jié)合。實驗證明， 許多RNA聚合酶與啟動子相結(jié)合的速率比布朗運動的隨機碰撞高。針對這些基因的啟動子的大量研究對確定特異性表達式的位置有重要意義，但實際情況較為復(fù)雜[12]。

2.2 轉(zhuǎn)錄水平

轉(zhuǎn)錄是精氨酰tRNA合成酶基因表達的必要條件。研究表明，抑制氨?；?tRNA合成酶基因可導(dǎo)致細胞生物學(xué)行為發(fā)生變化，如ATP消耗減少等，主要原因是抑制氨?；?tRNA基因轉(zhuǎn)錄可減少能量消耗。作為氨?；?tRNA合成酶之一的精氨酰tRNA合成酶基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制也可改變細胞的生物學(xué)行為。臨床研究顯示，基因轉(zhuǎn)錄受到抑制后導(dǎo)致能量消耗急劇下降，這是在長期缺氧環(huán)境下存活的的生物，如冬眠動物生存的一種行之有效的內(nèi)在機制。從轉(zhuǎn)錄水平來看，減少氧耗降低新陳代謝對生物適應(yīng)低氧環(huán)境有重要意義。此外，有研究表明，缺血預(yù)處理對視網(wǎng)膜細胞的保護作用與缺血預(yù)處理后參與氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運過程的氨基酰-tRNA合成酶和基因轉(zhuǎn)錄減少有關(guān)，繼而證明氨基酰-tRNA合成酶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制和功能降低是保護視網(wǎng)膜細胞的一種有效機制[13]。

2.3 翻譯水平

在哺乳動物中含有2種形式的精氨酰-tRNA合成酶，研究表明，這2種形式的酶是由同一條mRNA通過不同的翻譯起始得到的。真核生物普遍存在的現(xiàn)象，是由同一條 mRNA 選擇不同的翻譯起始位點，翻譯得到2條或2條以上翻譯產(chǎn)物[14]。對于精氨酰-tRNA合成酶，研究結(jié)果證實，就是通過“漏篩”和“再起始”2種機制翻譯得到的。精氨酰-tRNA合成酶除了在蛋白質(zhì)合成中的重要作用外，還是三向細胞連接處的關(guān)鍵中間體，一方面是針對蛋白質(zhì)生物合成，同時它也是泛素介導(dǎo)的通過N端規(guī)則途徑的蛋白質(zhì)降解和蛋白質(zhì)的翻譯后精氨化作用所必需的，故對其的研究是至關(guān)重要的[15]。

tRNAArg是 ArgRS 的作用底物， tRNAArg與精氨酰tRNA合成酶之間的準確識別是由個性元件決定的。在細菌tRNA中，主要的精氨酸決定簇限于兩三個核苷酸不同區(qū)域。反密碼子中的C 35和GU 36以及D環(huán)中高度保守的A 20。雖然在D環(huán)沒有主要的精氨酸決定簇，但tRNAIGG的識別在某種程度上依賴于位置20的核苷酸。

3 精氨酰tRNA合成酶基因在其他方面的研究

精氨酰tRNA合成酶作為參與蛋白質(zhì)合成的重要酶，對其研究也是熱點。對其反應(yīng)過程的動力學(xué)分析表明，ArgRS的特殊動力學(xué)特征是tRNAArg對ATP-PPi交換反應(yīng)的要求。由于類似于tRNA的要求，以前已將Arg RS與谷氨酰-tRNA合成酶一起分類為亞類Ic。然而，如果強調(diào)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，則將其與用于中性氨基酸的氨酰-tRNA合成酶一起置于亞類Ia中。許多關(guān)于Arg RS的動力學(xué)研究已經(jīng)使用雙底物動力學(xué)來解決3種底物的結(jié)合順序，特別是是否需要 tRNA以形成精氨酸或ATP的正確結(jié)合位點。此外，對其研究也表明在沒有PPi和AMP的情況下，速率限制不會發(fā)生在一個單一步驟中，而是分為4個步驟[16]。自然條件下，在低濃度的PPi和AMP存在下，速率限制發(fā)生在總反應(yīng)的后期步驟。

精氨酸系統(tǒng)也是種間差異明顯的一個例子，tRNA的種間氨基?；难芯恳呀?jīng)得出結(jié)論，真核氨酰-tRNA合成酶常常能夠利用大腸桿菌tRNA作為底物，這對于后續(xù)精氨酰tRNA合成酶的研究有重要意義。

實際應(yīng)用方面，刀豆氨酸與精氨酸的分子結(jié)構(gòu)僅僅是一個氧原子的差別，故它代替精氨酸作為 ArgRS 的一個底物，被催化連接到 tRNAArg上從而參與蛋白質(zhì)合成過程 。刀豆氨酸可摻入新合成的蛋白質(zhì)里，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變和功能喪失，從而產(chǎn)生細胞毒性[16]。在關(guān)于刀豆氨酸對大腸桿菌、酵母和人胞質(zhì)精氨酰-tRNA合成酶的抑制動力學(xué)中，發(fā)現(xiàn)刀豆氨酸對細菌精氨酰-tRNA合成酶的抑制作用要遠遠強于對人的抑制作用[1]，可被進一步作為抗菌藥物開發(fā)。

4 展 望

精氨酰-tRNA 合成酶(ArgRS)催化生成蛋白質(zhì)在核糖體上合成蛋白質(zhì)的原料，即精氨基酰-tRNA，來精確地識別對應(yīng)的氨基酸和 tRNA，確保了蛋白質(zhì)生物合成的高度忠實性[17]，在蛋白質(zhì)合成中起著至關(guān)重要的作用。作為三向細胞連接處的關(guān)鍵中間體，精氨基酰-tRNA 合成酶不僅針對蛋白質(zhì)生物合成，也在泛素介導(dǎo)的通過N端規(guī)則途徑的蛋白質(zhì)降解和蛋白質(zhì)的翻譯后精氨化作用起著必要作用，是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成不可或缺的酶。目前對其研究多在細菌等原核生物中，古細菌中對氨基酰-tRNA 合成酶與核糖體的相互作用也做了初步分析，在動物方面也有部分研究，但在植物中鮮有報道。以前的研究提出了tRNA氨基?；透叻肿恿考毎麖?fù)合物如細胞骨架或核糖體之間的聯(lián)系。然而，這些相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和潛在的機制尚不清楚。因此，從該基因的基礎(chǔ)功能入手，探索其在植物體中發(fā)揮的重要功能及內(nèi)在機理，對今后的研究有重要意義。

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