外泌體對胃癌轉移的作用及其在診斷中的應用研究進展*

胃癌是一種嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率位居各類惡性腫瘤第五位［1］。在全球，胃癌是惡性腫瘤導致死亡的第二大原因，在中國是第三大原因［2-3］。幽門螺桿菌感染是導致胃癌的主要原因之一，其次是慢性萎縮性胃炎、地域環(huán)境及遺傳因素等［4］。胃癌診斷的“金標準“包括內鏡檢查及活組織病檢，其為有創(chuàng)檢查，且大多數(shù)患者在早期并無明顯癥狀，故較多患者在診斷胃癌時已處于中晚期。盡管目前在胃癌的診斷和治療上取得了長足進展，但對于晚期胃癌，只有姑息手術或者保守治療等，患者的5年生存率仍然較低。胃癌的非侵入性血清標記包括CEA、CA19-9、CA72-4等，但這些標志物都沒有顯示出足夠的特異性和靈敏度，盡管臨床上通常會將這些標志物組合使用來配合診斷，但效果也差強人意。因此，迫切地需要研究新的非侵入性分子診斷標志物用于早期胃癌的臨床診斷。外泌體是近期眾多腫瘤研究的熱點，包括消化道腫瘤、骨腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等；它既是信號傳導的介導載體，也是改變腫瘤微環(huán)境的重要因素。

1 外泌體的生物學特性

外泌體是細胞主動分泌的直徑約40～100 nm的小囊泡，廣泛存在于各類體液中：血清、唾液、尿液、腹水、羊膜［5-7］等。外泌體可以攜帶蛋白質、脂質、DNA、RNA［7-8］等生物大分子物質，這些物質在細胞交流中起到了至關重要的作用［9］。外泌體的合成主要經(jīng)過兩種途徑：一種是依賴于轉運必需內體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT），包括ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Vps4；另一種則與ESCRT無關［7］。在近年的研究中，外泌體及其所攜帶的生物大分子物質被大量研究，由外泌體介導的細胞間交流不僅參與正常的生理調節(jié)，也參與許多疾病的病理過程，尤其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。正常細胞與腫瘤細胞均可分泌外泌體，其作為載體，將內容物釋放入循環(huán)血液中或從供體細胞轉運至鄰近或較遠的細胞內，在受體細胞中產(chǎn)生多種生物效應，包括細胞增殖、遷移及免疫反應等［10］。不同細胞來源的外泌體既有相同點，即內容物種類大致相同，但也有不同點。胃癌細胞分泌的外泌體較正常胃上皮細胞分泌的外泌體量更多、內容物更豐富，特別是各類RNA的數(shù)量。胃癌細胞外泌體中RNA的數(shù)量數(shù)倍于正常胃黏膜上皮細胞［11］，且腫瘤外泌體可能導致正常的基質成纖維細胞分化成肌纖維母細胞［12］，或將巨噬細胞誘導為腫瘤相關巨噬細胞［13］。

2 外泌體對胃癌的影響

2.1 外泌體對胃癌細胞增殖與轉移的影響

腫瘤微環(huán)境較復雜，包含腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞、細胞外基質及大量的包括炎性因子、趨化因子、生長因子在內的細胞因子等，這些細胞與各類細胞因子相互交流并促進血管生成、細胞增殖及遷移。已有研究表明腫瘤外泌體可以改變腫瘤微環(huán)境從而促進腫瘤細胞的增殖及遷移［14］。有研究顯示［15］，從胃癌細胞系SGC7901里提取的外泌體，可以激活SGC7901與BGC823兩種不同的胃癌細胞，機理研究表明：這些外泌體激活PI3K/AKT與MAPK/ERK信號通路，從而促進胃癌細胞的增殖。另一項研究顯示［16］，高表達CD97的胃腺癌細胞SGC-7901的外泌體與敲除CD97細胞的外泌體相比較，可以更加顯著地促進胃癌細胞的增殖及轉移。通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，這可能與CD97高表達的胃癌細胞分泌的外泌體激活MAPK信號通路有關。另一項關于CD97可以促進胃癌淋巴轉移的研究［17］表明，從高淋巴轉移性胃癌細胞株SGC-L及敲除CD97的SGCL（SGC-L/CD97-kd）細胞中分離出外泌體，分別注入胃癌小鼠模型體內，數(shù)日后發(fā)現(xiàn)，注射SGC-L細胞分泌的外泌體的小鼠腘窩及腹股溝淋巴結內有較多的轉移性腫瘤細胞，而注射SGC-L/CD97-kd細胞分泌的外泌體的小鼠淋巴結內僅有數(shù)個轉移性腫瘤細胞。Yang等［18］的研究表明，胃癌外泌體中某些miRNA的表達水平與胃癌的轉移有顯著相關性，在敲除miR-423-5P后，胃癌的淋巴結轉移明顯減弱。miR-423-5P通過抑制融合蛋白抑制因子（suppressor of fused protein，SUFU），從而促進胃癌轉移［18］。腹膜由間皮細胞及結締組織構成，是抵御腫瘤附著的第一道屏障，胃癌外泌體可以破壞腹膜屏障從而促進胃癌的腹膜轉移。胃癌衍生的外泌體可以誘導間皮細胞凋亡破壞腹膜屏障，使臟器不同程度的暴露于腹腔，并建立纖維化的轉移前微環(huán)境加速胃癌的腹膜轉移。此外，胃癌細胞衍生的外泌體還可以增強胃癌細胞與正常細胞之間的黏附力，加強胃癌細胞的侵入性及遷移能力，促進胃癌的腹膜轉移［20］。因此，胃癌外泌體直接或間接影響胃癌細胞的增殖及遷移能力，參與胃癌的進展，是導致胃癌復發(fā)及轉移的重要因素。

2.2 外泌體參與腫瘤轉移前微環(huán)境的建立

腫瘤轉移是一個多聯(lián)級的復雜過程，且癌細胞并不是漫無目的的廣泛擴散。目前已有研究證實癌細胞外泌體所攜帶的生物活性分子可以被特定的器官所吸納，參與腫瘤轉移前微環(huán)境的建立。Zhang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞分泌的外泌體可以調節(jié)肝臟的微環(huán)境，為胃癌的肝臟轉移“做好準備”。胃癌患者血清中含有豐富的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），EGFR被胃癌細胞外泌體運送至肝臟，并通過抑制miR-26a/b從而激活肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的表達，而HGF被認為是一種腫瘤促進劑［22］，其高表達最終促進胃癌的肝轉移。這一研究驗證了臨床中流行的關于腫瘤轉移機制的“土壤與種子”假說。另一項研究表明［23］，胃癌、直腸癌、胰腺癌、乳腺癌等均具有轉移到特定器官（肝、肺、腦）的傾向。在對其外泌體分析后發(fā)現(xiàn)，外泌體整合素以組織特異性方式與靶細胞融合進行器官特異性移植，從而啟動轉移前微環(huán)境的形成。不僅如此，外泌體中miRNA可以增強內皮細胞的通透性及上調一些基因的表達而引起血管重塑，為轉移來的癌細胞提供充足的“養(yǎng)分”［24］。綜上所述，外泌體參與腫瘤轉移前微環(huán)境的形成，且在不同步驟中扮演不同的角色，包括代謝重編程、免疫及非免疫基質的招募等，是連接“種子”與“土壤”的信使，為腫瘤的轉移營造了適宜的微環(huán)境。

2.3 外泌體通過調節(jié)宿主免疫對胃癌轉移能力的影響

外泌體還可以通過改變腫瘤免疫微環(huán)境，進而影響腫瘤的進展［25］。Wu等［26］研究顯示，胃癌細胞分泌的外泌體可以通過激活腫瘤相關巨噬細胞來增強胃癌細胞的增殖及遷移能力，正常胃上皮細胞的外泌體卻不具備這樣的功能。研究表明：胃癌細胞的外泌體可以被巨噬細胞吞噬，激活NF-κB通路，促進炎性因子（IL-6、TNF-α、CCL2）的表達，從而發(fā)揮其功能。胃癌外泌體中TGFβ1可以誘導免疫抑制性的調節(jié)性T細胞（Treg）形成，幫助癌細胞逃避宿主的免疫監(jiān)視，從而導致癌細胞可以輕易的進行淋巴轉移［27］。另一項研究報道［28］，胃癌衍生的外泌體可以誘導腫瘤相關巨噬細胞，產(chǎn)生大量的IL-10，削弱細胞毒活性CD8+的T細胞，從而為胃癌的轉移創(chuàng)造有利條件。此外，也有研究顯示［29］，高溫可以增強胃癌患者惡性腹水中外泌體的免疫原性，從而緩解胃癌的進展?？梢?，外泌體對于胃癌免疫調控具有雙重作用，若充分利用其免疫原性，將會為胃癌的治療提供幫助。

3 外泌體作為胃癌診斷的標志物

胃癌的進展階段是影響其預后的重要因素，晚期胃癌患者5年生存率較低。早期胃癌診斷率較低，且易被誤診、漏診。因此，研究新型非侵入性及高靈敏度的腫瘤標志物檢測早期胃癌很有必要。血液中的腫瘤標志物目前已被廣泛運用于輔助癌癥的診斷以及治療預后的判斷，如AFP、PSA、CEA、CA19-9分別作為診斷肝癌、前列腺癌、結腸癌以及胰腺癌的分子標志物。外泌體廣泛存在于各類體液中，具有較好的穩(wěn)定性，便于提取，其與親代腫瘤細胞之間具有較高的相似度，因此很適合作為診斷標志物［30］。外泌體及其攜帶的生物大分子，如蛋白質及RNA等具有被用作新型腫瘤生物標記物的潛力。

3.1 血清外泌體中miRNA的診斷價值

外泌體中miRNA有作為分子診斷標志物的潛力。Zhou等［31］的研究中，分析了242例（133例胃癌患者，109例正常人）血清中不同miRNA的表達，與正常人血清相比，胃癌患者血清中miR-185、miR-20a、miR-210、miR-25、miR-92b顯著增加，且miR20a已被廣泛證明是胃癌潛在的分子診斷標志物［32-33］。另一項研究［34］發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清外泌體中miR-19b-3p及miR-106a-5p表達水平明顯高于正常人。研究者根據(jù)實驗設計了可以檢測胃癌的公式，根據(jù)此公式進行的一項雙盲測試，包括20例胃癌患者和20例正常人，兩種miRNA（miR-19b-3p、miR-106a-5p）正確的區(qū)分了20例胃癌患者中的19例（靈敏度95%），和20例正常人中的18例（特異性90%）。另外，胃癌患者血清外泌體中的miR-423-5P水平也顯著高于正常人。有研究［18］發(fā)現(xiàn)在胃癌組織與胃癌細胞SGC-7901及HGC-27中，miR-423-5P的水平均高于正常組織及正常的胃黏膜上皮細胞。通過與傳統(tǒng)腫瘤標志物比較，外泌體中miR-423-5P的診斷特異性及敏感性均高于CEA和CA-199。胃癌的腹膜種植轉移預后較差。為了防止胃癌腹膜種植轉移，在胃癌根治術關腹前通常用溫熱蒸餾水反復沖洗腹腔。有研究發(fā)現(xiàn)［35］，胃癌患者腹腔沖洗液中miR-21及miR-1225-5P可能為癌細胞的傳播和沉降作“準備”，故可以將這兩種miRNA作為胃癌根治術后腹膜種植轉移的診斷標志物，這也將為臨床術后胃癌腹膜轉移早期的診斷及治療提供幫助。

3.2 血清外泌體中l(wèi)ncRNA的診斷價值

miRNA已被廣泛證實有望成為胃癌的診斷標志物，lncRNA能否有效的用于診斷早期胃癌也被大量地進行研究。lncRNA與mRNA有相似的特征，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移中起著廣泛的作用，可以反映腫瘤的進展狀態(tài)，表明lncRNA具有作為腫瘤診斷的潛力［36］。利用RNA測序分析早期胃癌細胞外泌體，檢測到lncUEGC1及l(fā)ncUEGC2表達較正常胃上皮細胞增高。在穩(wěn)定性測試中，用RNA酶處理過的血漿外泌體lncUEGC1并無顯著變化，但lncUEGC2量減少了兩倍，研究猜測lncUEGC1完全包被于外泌體中，而lncUEGC2僅部分包被。進一步比較lncUEGC1及l(fā)ncUEGC2對于診斷早期胃癌的敏感性，發(fā)現(xiàn)兩種lncRNA均高于傳統(tǒng)的腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA72-4、CA12-5等［37］。此外，Pan等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞外泌體的lncRNA ZFAS1表達較正常胃黏膜上皮細胞高，因此胃癌患者血清中ZFAS1的水平也顯著高于正常人。ZFAS1不僅可以促進胃癌細胞的增殖及遷移，其表達與胃癌的淋巴轉移和TNM分期也有顯著關聯(lián)。ZFAS1表達水平與腫瘤的密切相關性表明其可能是胃癌診斷和預后的一種新標志物。進一步測試發(fā)現(xiàn)ZFAS1診斷胃癌的靈敏度和特異性分別為50%和78.7%。

3.3 血清外泌體中蛋白質的診斷價值

胃癌外泌體中的蛋白質也可以在腫瘤早期的診斷、檢測和預后評價中發(fā)揮一定作用。Gastrokine1（GKN1）是一種由胃上皮細胞分泌的蛋白質，體內及體外實驗均表明其可以抑制胃癌細胞增殖及誘導胃癌細胞凋亡。此外，GKN1可與胃癌細胞分泌的27種蛋白質結合，從而導致胃癌患者血清GKN1濃度降低。因此，通過抽取健康受試者與胃癌患者、肝癌患者及結直腸癌患者血清，分析發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中GKN1的濃度明顯低于其他三組。故GKN1不僅有望成為診斷胃癌的標志物，同時也可能成為延緩胃癌進展和治療胃癌的靶點［38］。此外，既往研究證實，在胃癌患者血清中外泌體數(shù)量明顯高于正常人，且HER-2/neu、c-MET、MAGE-1等一系列蛋白的表達顯著增加，這些外泌體內蛋白都具有成為胃癌診斷標志物的潛力［39］。

4 結語

在腫瘤細胞與正常細胞的交流中，外泌體扮演著重要的角色，通過釋放各種生物分子，影響腫瘤微環(huán)境及腫瘤的進展。外泌體作為胃癌診斷標志物擁有較多優(yōu)勢，首先，外泌體體積較小易于透過各種組織屏障，循環(huán)系統(tǒng)中易于提取；其次，外泌體中RNA及蛋白質與胃癌的病理狀態(tài)具有一定的相關性，可以實時準確地反映腫瘤的病理進展狀態(tài)；最后，外泌體的脂質膜可以很好地保護RNA及蛋白質不被降解，其穩(wěn)定性利于其成為胃癌非侵入性診斷的理想選擇。不僅是胃癌，外泌體已被證實在肺癌、前列腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中高表達，是未來腫瘤治療、判斷預后、早期診斷的新研究領域。外泌體影響腫瘤進展的機制已得到廣泛的研究及關注，目前的研究主要集中于如何有效地將其應用于腫瘤的早期診斷及預后的預測，未來也可以探究外泌體是否可以作為腫瘤藥物的靶向載體，實現(xiàn)殺傷腫瘤細胞，破壞腫瘤細胞生存的微環(huán)境，甚至實現(xiàn)腫瘤的治愈。雖然目前關于腫瘤外泌體的研究甚多，但很多關鍵性機制尚不明確，故外泌體在腫瘤發(fā)展中的機理仍具有巨大的研究價值。