PLIN2對(duì)脂類代謝的調(diào)控研究

胡瀕月 黃 英 楊明華 潘洪彬 趙素梅

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201

PLIN2 作為一種脂肪分化相關(guān)蛋白分布在脂滴表面，參與脂質(zhì)代謝，用于了解機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)蓄積的程度。當(dāng)機(jī)體受病理因素影響時(shí)，便打破了PLIN2 與中性膽固醇酯水解酶（NCEH）之間的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致PLIN2 過度表達(dá)，NCEH 阻止膽固醇的外流，使得細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯大量蓄積形成泡沫細(xì)胞，而泡沫細(xì)胞的形成作為早期動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）的一個(gè)典型特征[1]。本文旨在探討引起PLIN2 過度表達(dá)的機(jī)制之間的相互關(guān)系，為早期動(dòng)脈粥樣硬化病癥的治療提供理論依據(jù)。

1 脂滴的研究

三酰甘油（TG）和膽固醇酯（CE）是人體中主要的中性脂質(zhì)。由于它們的疏水性，中性脂質(zhì)不溶于水，自發(fā)形成聚集體以使脂質(zhì)-水界面最小化。脂滴由位于中心的中性脂質(zhì)如三酰甘油、膽固醇酯和外圍包裹的磷脂單分子層構(gòu)成，之前的蛋白質(zhì)組學(xué)分析已經(jīng)證明各種來源不同的胞內(nèi)脂滴（LDs）蛋白質(zhì)譜[2-3]。此外，在免疫細(xì)胞化學(xué)分析中，某些LD 蛋白已經(jīng)明顯定位于LD 顆粒上[4]，據(jù)報(bào)道LD的磷脂組合物不同與肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的細(xì)胞膜[5]。這些觀察導(dǎo)致LDs 作為獨(dú)特的細(xì)胞器被廣泛接受[6]。

盡管據(jù)報(bào)道細(xì)胞內(nèi)LDs 無(wú)處不在，但是它們的中性脂質(zhì)成分在細(xì)胞和組織類型之間變化。尤其是，單分子LDs 在白色脂肪組織（WAT）中占據(jù)相當(dāng)大部分的胞質(zhì)溶膠，這是哺乳動(dòng)物脂肪貯存的部位。盡管肝臟是主要的脂質(zhì)代謝器官，但在生理?xiàng)l件下存在數(shù)量有限。然而，脂肪肝中過量的脂質(zhì)積累與胞質(zhì)LDs 的數(shù)量和大小相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞從脂蛋白中積累大量的TG 和CE。并且，特定的激素分泌細(xì)胞含有膽固醇可以存儲(chǔ)脂滴，它可以產(chǎn)生類固醇激素。

2 PAT家族的研究

脂滴相關(guān)蛋白存在于脂滴表面，這些蛋白調(diào)節(jié)著脂滴中脂肪的合成與分解代謝。目前，很多科研學(xué)者都熱衷于脂滴相關(guān)蛋白的研究。adipophilin、Perilipin、TIP47 都能與脂滴結(jié)合，以這三個(gè)蛋白名字的首字母命名即為“PAT” 家族蛋白。PLIN1 和PLIN2 的N-和C-末端區(qū)域以及中央部分是LD定位所需的[7]。另一項(xiàng)最近的研究表明，11-mer 重復(fù)形成能夠結(jié)合膠束和LD 的兩親螺旋[8]。因此，PLIN1-3 的11-mer 重復(fù)中的各種點(diǎn)突變改變了兩親性氨基酸比對(duì)并消除了LD 締合。在其他蛋白質(zhì)，包括載脂蛋白和帕金森氏病蛋白α-突觸核蛋白中發(fā)現(xiàn)了11 個(gè)堿基的重復(fù)序列[9]，據(jù)報(bào)道它可以結(jié)合脂質(zhì)負(fù)載的海馬神經(jīng)元中的LD 相關(guān)蛋白[10]。

3 PLIN2基因結(jié)構(gòu)和分布特征

眾所周知，PLIN2 是主要的肝臟LD 蛋白[11]，PLIN2 基因的CDS 全長(zhǎng)為1380bp，編碼459 個(gè)氨基酸；PLIN2 蛋白推測(cè)的氨基酸序列的等電點(diǎn)為6.18，理論分子量為50179.76Da，總平均疏水指數(shù)為-0.365，為親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)共有283 個(gè)螺旋、5 個(gè)延伸和171 個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)，存在35 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，5 個(gè)糖基化位點(diǎn)，有3 條跨膜螺旋。它與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，皮脂腺細(xì)胞和哺乳動(dòng)物腺上皮細(xì)胞有關(guān)，并且它的表達(dá)是無(wú)處不在[12]。PLIN2最初被命名為脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP），反映了它參與誘導(dǎo)早期脂肪細(xì)胞分化[13]。然而，PLIN2 存在于未成熟脂肪細(xì)胞中，在成熟脂肪細(xì)胞分化過程中被 PLIN1 取替[14]。

4 PLIN2 2的表達(dá)和調(diào)控

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源性FFA增加時(shí)PLIN2 mRNA 表達(dá)上調(diào)，但體內(nèi)新生成的FFA 并不會(huì)影響PLIN2 mRNA 的表達(dá)[15]。因此，當(dāng)外源性游離脂肪酸過多，肝細(xì)胞將觸發(fā)PLIN2 相關(guān)機(jī)制使得游離脂肪酸以三酰甘油的形式存儲(chǔ)以備將來使用，當(dāng)外源性FFA 分泌不夠時(shí)，便會(huì)促使合成脂肪酸，并以TG的形式轉(zhuǎn)化為極低密度脂蛋白（VLDL），然后分泌到周邊需要TG 的組織中[4]。此外，PLIN2 敲除小鼠對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖，脂肪性肥胖具有抗性，肝臟疾病和酒精引起的脂肪變性，說明了PLIN2 負(fù)責(zé)脂質(zhì)積聚，特別是在肝臟中[16-17]。綜上所述，這些研究表明PLIN2 促進(jìn)LD 形成，從而保護(hù)TG 免受脂解。

Plin2（adipophilin）基因的表達(dá)還受著PPAR的調(diào)節(jié)，adipophilin 基因啟動(dòng)子上有著PPARs 的調(diào)節(jié)元件PPRE，在肝細(xì)胞中有PPARα 參與調(diào)節(jié)，而角蛋白細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)的則是PPARβ /δ，劉志強(qiáng)等[18]實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)研究顯示，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）能激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2）， 抑制 ERK1/2 的活性則會(huì)抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的adipophilin 和PPARγ的表達(dá)，最終抑制脂質(zhì)蓄積。在RAW264.7 細(xì)胞中加入 PPARγ 的抑制劑，抑制 ERK1/2 的活性，使得 adipophilin 的表達(dá)升高，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。 這些結(jié)果表明 adipophilin 的表達(dá)與 ERK1/2-PPARγ 途徑有關(guān)[19]。PPAR 敏感的轉(zhuǎn)錄因子與類維生素X 受體（RXR）異源二聚化，據(jù)報(bào)道二十二碳六烯酸（DHA）是RXR 的天然配體[20]。因此，我們證明PPARγ 和RXR 參與了BeWo 人絨毛膜癌細(xì)胞中PLIN2 誘導(dǎo)的LD 形成[21]。

先前的研究表明，Plin2 mRNA 表達(dá)受PPARs和RXR 調(diào)節(jié)。但是，細(xì)胞PLIN2 蛋白水平與TG儲(chǔ)存水平相關(guān)。BeWo 細(xì)胞在加入DHA 后積累PLIN2 陽(yáng)性LDs，而用合成的RXR 激動(dòng)劑治療增加Plin2 mRNA 表達(dá)，但不增加PLIN2 蛋白水平[6]，可能反映了PLIN2 翻譯和降解。DHA誘導(dǎo)Plin2m RNA 表達(dá)并且可以通過產(chǎn)生TG 穩(wěn)定PLIN2 蛋白水平，而合成的RXR 激動(dòng)劑可能不促成TG 合成。巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞在不存在脂質(zhì)源的條件下培養(yǎng)時(shí)具有減少的LD 數(shù)量和PLIN2 蛋白質(zhì)的量。此外，蛋白酶體抑制劑MG132 保護(hù)PLIN2 蛋白水平，并導(dǎo)致聚泛素化的PLIN2在巨噬細(xì)胞中的積累。類似地，在PLIN2 轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞和間充質(zhì)胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）衍生的脂肪細(xì)胞中證實(shí)了泛素介導(dǎo)的PLIN2 的蛋白水解[22]因此，盡管PLIN2 在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量高的情況下可以穩(wěn)定LD，但在脂質(zhì)貧乏的條件下其可能被泛素-蛋白酶體途徑降解。在一項(xiàng)相關(guān)的研究中，利用轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達(dá)的蛋白酶體亞基β5t 體內(nèi)細(xì)胞LD積累，調(diào)控PLIN2 蛋白酶水解作用的參與[23]。與高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠相比，該轉(zhuǎn)基因小鼠顯示更弱的蛋白酶體胰凝乳蛋白酶樣活性和嚴(yán)重的肝脂質(zhì)積累。雖然在這些轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟中PLIN2含量增加了，但其他一些LD 相關(guān)蛋白沒有改變。有文獻(xiàn)報(bào)道以小鼠成骨肌細(xì)胞C2C12 敲除PLIN2基因?yàn)槟Ｐ脱芯恐惔x以及脂滴表面蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)PLIN2 基因被沉默后，降低成骨肌細(xì)胞合成能力，并減弱水解TAG 的能力。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，雖然胞內(nèi)脂滴數(shù)目減少，但是脂滴的大小增大，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察后發(fā)現(xiàn)敲除PLIN2 后，細(xì)胞合成PC 和TAG能力顯著增強(qiáng)[24]。

Adipophilin 基因不僅受游離脂肪酸和PPAR調(diào)節(jié)，據(jù)報(bào)道，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢成纖維細(xì)胞經(jīng)油酸孵育后，PLIN2 蛋白含量增加，當(dāng)不再用培養(yǎng)液后，發(fā)現(xiàn)PLIN2 蛋白表達(dá)量降低，蛋白酶體抑制劑MG132可以逆轉(zhuǎn)這種影響，可用脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證MG132 能限制PLIN2 的降解。降解PLIN2 的環(huán)境促使泛素改變它的共價(jià)鍵，然而用油酸培育，不僅能使TG 不斷積聚還能阻止PLIN2 被泛素化，說明泛素/ 蛋白酶體可以調(diào)控PLIN2 翻譯后的降解。另有研究表明，在肝細(xì)胞中自噬可作為一種額外途徑降解PLIN2 和TG 從而促進(jìn)脂滴分解[25-26]。通過添加3-甲基腺苷抑制自噬或抑制Atg5、Lamp2 蛋白表達(dá)可以促進(jìn)脂質(zhì)加速積累，說明自噬參與了肝臟中的脂質(zhì)消耗。另外，有報(bào)道指出，在酵母的脂滴中的脂質(zhì)對(duì)于誘導(dǎo)自噬發(fā)生是必需的，并且脂質(zhì)可作為自噬小體的底物[27]。具有基因修飾TG 或固醇酯合成缺少LDs 的酵母中，自噬被抑制。另外，編碼TG 和固醇酯的脂肪酶與自噬有關(guān)。因此，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成，降解和儲(chǔ)存平衡的過程是相互調(diào)節(jié)的。在脂肪細(xì)胞的成熟過程中，PLIN2 被PLIN1 所取代，但是PLIN2 的mRNA 水平仍然很高，并且降解PLIN2 的蛋白酶體是激活狀態(tài)的。Takahashi等人認(rèn)為第2 和第3 個(gè)丙氨酸殘基對(duì)于誘導(dǎo)泛素化的發(fā)生以及接下來降解蛋白是必不可少的[28]。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來源的脂肪細(xì)胞中，胞質(zhì)中的PLIN2 容易被降解，而與LD 穩(wěn)定有關(guān)的PLIN2 則不容易降解。

據(jù)報(bào)道，中性膽固醇酯水解酶（NCEH）是一種微粒體酶，膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1（ACAT1），過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）這幾種酶均能參與脂質(zhì)代謝的調(diào)控，NCEH 能水解膽固醇酯為長(zhǎng)鏈脂肪酸和游離膽固醇，ACAT1 則與它不同，，它能催化長(zhǎng)鏈脂肪酸和游離膽固醇連接形成膽固固醇酯。另外，由于nCEH 和 ACAT1 與adipophilinn所在區(qū)域非常接近，nCEH 抑制脂質(zhì)積累，ACAT11和 Adipophilin 則相反，它們促進(jìn)脂質(zhì)積聚，說明明 adipophilin 與 ACAT1 有協(xié)同作用甚至可能結(jié)合，adipophilin 可能會(huì)與 nCEH 結(jié)合并抑制 nCEH 的活活性[28]。在動(dòng)脈粥樣化的診斷中，蛋白激酶C（PKC）磷酸化adipophilin，將PKC 激動(dòng)劑和THP-1 巨噬噬細(xì)胞荷脂共同孵育，可以觀察PKC 被激活，同時(shí)時(shí)可以協(xié)同氧化低密度脂蛋白，PPARγ、PKCα 和和adipophilin 表達(dá)均上調(diào)，極大地加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)脂滴滴的積累[29]。而使用PKC 抑制劑Calphostin C 則會(huì)逆轉(zhuǎn)oxLDL 誘導(dǎo)的酶活化和PKCα、PPARγ 和 adipophilin 表達(dá)的上調(diào)[30]。

5 PLIN2的功能

在脂肪細(xì)胞分化初期，PLIN2 蛋白在脂滴表面表達(dá)，PLIN2 的mRNA 表達(dá)量上升而蛋白表達(dá)量降低，脂滴包被蛋白（perilipin）的蛋白表達(dá)量和mRNA 也增強(qiáng)，perilipin 蛋白取代 PLIN2 包被于脂脂滴表面，所以PLIN2 蛋白在成熟的脂肪細(xì)胞的脂滴表面以及分化后期不表達(dá)。敲除PLIN2 基因的小鼠成為了研究PLIN2 在整體水平功能的有力工具，令人意想不到的是，PLIN2 基因敲除后，脂肪細(xì)胞的的形態(tài)和脂肪組織的重量并沒有什么改變[31]。PLIN2基因敲除組小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mice embryonic fibroblast，MEF）可以正常誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，說明 PLIN2 在脂肪分化過程中作用并不是至關(guān)重重要的[32]。有研究認(rèn)為PLIN2 屏障功能的實(shí)現(xiàn)可能是通過阻止酶脂肪細(xì)胞甘油三酯脂酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）與的脂滴表面接觸[33]。另有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞內(nèi)脂滴的運(yùn)輸機(jī)制與水性囊泡的相似，脂滴的融合能被諾考達(dá)唑（nocodazole）解聚微管抑制，再用免疫共沉淀的方法去檢測(cè)PLIN2與動(dòng)力蛋白（dynein）是否結(jié)合，這說明動(dòng)力蛋白的參與后，脂滴便可以借助微管系統(tǒng)進(jìn)行運(yùn)輸，而PLIN2 蛋白在介導(dǎo)碎裂脂滴重新融合中的作用至關(guān)重要[34]。所以PLIN2 可以主動(dòng)調(diào)控TG，并不是一個(gè)被動(dòng)的保護(hù)屏障。

6 展望

就目前研究來看，PLIN2 不僅作為一種特異性性標(biāo)記物來判斷動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)的蓄積程度，對(duì)多種代謝性疾病如病理性肥胖、脂肪肝及胰島素抵抗等都有影響，其表達(dá)也受多種因素調(diào)控。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，我們有必要對(duì)PLIN2 分子生物學(xué)特性進(jìn)行深入了解，尤其它在調(diào)控炎癥介質(zhì)分泌過程中起到什么作用。我們的研究從細(xì)胞水平和分子上討論P(yáng)LIN2 基因的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步為PLIN2 基因作為標(biāo)記基因進(jìn)行深人而全面的研究提供理論依據(jù)。