上皮間質轉化在非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥中的研究進展

虞莉 黃沙 呂望 何哲浩 胡堅

據統(tǒng)計，我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9%，肺癌已成為我國首位惡性腫瘤死亡原因，2015年流行病學調查研究結果預測2015年中國新發(fā)肺癌數及死亡數分別為733.3/千人和610.2/千人，其中有80%的病例為非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）[1]。近年來，隨著以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）為代表的NSCLC驅動基因突變的研究進展，分子靶向藥物得到廣泛的應用。19外顯子缺失、21外顯子點突變（L858R）是目前已知EGFR最常見的突變類型，且和患者的臨床特點有一定的相關性，多見于腺癌、亞洲人種、女性以及不吸煙人群。而這類基因突變患者對第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）如吉非替尼和厄洛替尼，往往是敏感的。其有效率可高達80%，無進展生存期顯著延長[2]，但有一部分EGFR突變患者對EGFR-TKIs原發(fā)耐藥，且即使對其敏感的患者在治療過程中也不可避免地產生耐藥，有關耐藥機制的研究主要集中在T790M、KRAS突變，c-Met原癌基因擴增等方面。近來研究發(fā)現，EGFR-TKIs耐藥與腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）密切相關，目前已成為NSCLC EGFR-TKIs耐藥研究領域中的一大熱點。

1 EGFR-TKIs耐藥相關機制

目前，EGFR-TKIs耐藥機制尚未完全闡明，研究主要集中在以下幾個方面：①EGFR基因再突變，其中約50%的患者都是由于EGFRT790M突變引起的耐藥，目前有“亞克隆”和“誘導突變”這兩大學說來解釋EGFR基因T790M再突變現象，此外，D761Y、L747S和T854A等非T790M再突變也會使NSCLC對EGFR-TKIs的治療敏感性下降；②K-RAS突變，K-RAS是一種GTP酶，參與一系列細胞重要活動，而K-RAS中第2外顯子區(qū)域的12和13密碼子突變可持續(xù)激活RAS，進而誘發(fā)腫瘤對EGFR-TKIs的耐藥，其中80%的突變都發(fā)生在12密碼子；③c-Met擴增，c-Met是一類受體酪氨酸激酶，參與TK結構域激活以及增殖、遷移、侵襲等各類細胞活動的活化過程，正常生理調控下在穩(wěn)態(tài)維持方面可起到重要作用，而c-Met原癌基因的擴增可導致下游PI3K/AKT通路的異?；罨鹉[瘤對EGFR-TKIs的耐藥；④上皮來源腫瘤獲得間質樣表型（EMT現象）引起的EGFR-TKIs耐藥[3]。Chung等[4]報道了1例NSCLC患者在厄洛替尼治療出現進展后，復發(fā)灶穿刺樣本證實上皮標記E-Cadherin表達陰性，高表達間質細胞標記Vimentin；并且在體外CL-387、785（EGFR-TKIs）肺癌耐藥株HCC827/CLR中重復了EMT表型。Suda等[5]將EGFR-TKIs敏感的肺癌HCC4006細胞用低劑量厄洛替尼持續(xù)誘導得到耐藥株HCC4006/ER，分析細胞表型發(fā)現E-Cadherin表達缺失，而高表達間質細胞標記Vimentin，證實EMT也是EGFRTKIs獲得性耐藥機制之一；⑤耐藥蛋白通過藥物外排途徑介導EGFR-TKIs耐藥。Ozvegy-Laczka等[6]通過系列體外實驗發(fā)現吉非替尼和多藥轉運蛋白ABCG2間存在極高的親和力，可抑制其介導的藥物外排，也提示ABCG2等多藥轉運蛋白通過促使TKIs外排介導EGFR-TKIs耐藥的可能；⑥細胞凋亡缺陷引起EGFR-TKIs耐藥。BIM是Bcl-2促凋亡家族成員之一，也在介導EGFR-TKIs誘導細胞凋亡過程中起著重要作用，Faber等[7]的研究發(fā)現，在BIM mRNA低表達或多態(tài)性缺失的情況下，腫瘤細胞可逃避EGFR-TKIs誘導的細胞凋亡。

2 EMT在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中的作用

EMT是一類生物學基本現象，即上皮細胞轉化為間質表型細胞，目前研究表明，其在腫瘤進展的過程也發(fā)揮了一定的作用。EMT過程中，上皮細胞標志物表達下調，如N-Cadherin、E-Cadherin，而Vimentin、纖連蛋白等間質標志物表達上調。Ren等[8]開展了一項回顧性研究，納入202例晚期NSCLC患者，比較EGFR-TKIs藥物有效率和患者用藥前EMT基線表型之間的相關性，他們發(fā)現，上皮表型多見于EGFR突變的患者，且與野生型相比，EGFR突變患者的預后更好。此外，腫瘤細胞表型并不是固定不變的，經過化療或靶向等治療后，起初的EMT表型或許會發(fā)生變化，例如烷化類化療藥如順鉑，就可能會誘導EMT[9]，繼而產生吉非替尼耐藥。在EGFR-TKIs耐藥人群二次活檢樣本中，間質標志物表達增多，而上皮標志物表達陽性的患者，EGFR-TKIs藥物治療效果更好，即藥物治療有效率更高，無進展生存期更長。此外還有研究表明，NSCLC細胞系上皮表型恢復后，原本耐藥的細胞重獲對吉非替尼的敏感性?，F從腫瘤微環(huán)境、信號通路、表觀遺傳3個方面總結目前對EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥機制的研究進展。

2.1 腫瘤微環(huán)境介導EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥NSCLC腫瘤微環(huán)境由細胞成分和細胞外基質（excetral cellular matrix, ECM）組成，而細胞成分則由腫瘤細胞和周圍腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）等其他間質細胞構成。CAFs可以通過釋放TGF-β、細胞因子、趨化因子等誘導NSCLC細胞發(fā)生EMT，也可以釋放基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）來調節(jié)細胞外基質，間接影響EMT過程[10]。Choe等[11]發(fā)現，PC9細胞在和CAFs共培養(yǎng)的過程中可發(fā)生EMT現象，七次跨膜蛋白SMO表達上調，Hedgehog信號通路顯著激活，進而對厄洛替尼產生耐藥。康小紅等[12]發(fā)現，腫瘤微環(huán)境中的HGF可通過參與EMT進程介導了NSCLC對阿法替尼的原發(fā)耐藥。Reckamp等[13]認為微環(huán)境中COX-2高表達可介導PGE2依賴的EMT，引起TKI耐藥。而腫瘤細胞、巨噬細胞等細胞成分均可向微環(huán)境分泌COX-2等分子。

以上研究表明，腫瘤微環(huán)境中的間質細胞及其分泌的生物細胞因子參與EMT介導的TKIs耐藥。

2.2 信號通路介導EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥 EMT的發(fā)生由細胞內信號轉導通路精確調控，細胞外信號與細胞膜上相關受體結合，將信號傳至細胞內，激活細胞內核轉錄因子，調控相關基因表達。而目前研究發(fā)現，在EMT介導NSCLC對EGFR-TKIs耐藥的過程中，有多條信號通路被激活，包括SRC/FAK信號通路、Notch信號通路、Hedgehog信號通路以及IGF1R信號通路等，它們通過協(xié)同、拮抗相互交叉對NSCLC的EMT過程進行調節(jié)，進而誘導耐藥產生。

2.2.1 SRC信號通路介導EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥 Li等[14]研究，SRC抑制劑達沙替尼可通過抑制SRC/FAK信號通路對EMT相關的厄洛替尼耐藥NSCLC患者起效，Wilson等[15]也通過體外實驗證實達沙替尼可通過SRC/FAK信號通路降低EMT誘導的EGFR-TKIs耐藥細胞的活性，且進一步篩選出該通路中和耐藥關系較密切的幾種磷酸激酶（EPHB1、FAK以及ACK-1）。此外，SRC還可通過調控下游的AKT和MEK誘導EMT相關的TKI耐藥[16]。

2.2.2 Notch信號通路介導EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥近期研究表明，Notch通路也參與EMT相關的TKI耐藥，和多種EMT轉錄、生長相關分子存在相互作用，包括Snail、Slug、TGF-β、FGF及PDGF等，Xie等[17]發(fā)現在吉非替尼耐藥細胞株PC9/AB2中，Notch-1 mRNA及蛋白均呈高表達狀態(tài)，但Notch家族其他成員（Notch-2-4）的表達量卻無明顯改變，Notch-1受體N1IC轉入EGFR-TKIs敏感的PC9細胞后，可出現EMT現象且細胞對吉非替尼敏感性下降，反之，用siRNA沉默耐藥細胞株的Notch-1后，可逆轉上述現象，進一步研究其內在通路發(fā)現，p21 Waf1/Cip1可調節(jié)cyclin D1的表達，cyclin D1經β-catenin依賴的Wnt信號通路介導Notch-1 DNA組蛋白修飾來調節(jié)Notch1的表達，而Notch-1下游的靶基因Hes-1可抑制p21 Waf1/Cip1啟動子的轉錄，在EMT相關耐藥細胞中，Notch-1、cyclin D1表達上調，而p21 Waf1/Cip1則表達下調。

2.2.3 Hedgehog信號通路介導EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥 Bai等[18]發(fā)現，NSCLC對EGFR-TKIs敏感的情況下，hedgehog（Hh）信號通路是沉默的，在耐藥時則呈激活狀態(tài)。外源性激活Hh信號通路可通過介導EMT誘導耐藥。反之，GDC-0449抑制EMT表型細胞中Hh信號通路后，miR-200b和let-7c表達上調，細胞對藥物的敏感性增加[19]。

2.2.4 Hippo信號通路介導EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥Hippo通路中TAZ表達上調，抑制靶基因（CTGF,AXL）的表達[20]以及TGFβ-miR200-MIG6等過程[21]，均和EMT相關的TKI耐藥有關。

2.2.5 IGF1R信號通路介導EMT效應獲得EGFR-TKIs耐藥此外，還發(fā)現IGF1R 激活ERK/AKT進而上調Snail的表達介導EMT引起EGFR-TKIs耐藥，逆轉EMT后能恢復耐藥細胞系對EGFR-TKIs的敏感性[22]。

2.3 表觀遺傳調控EMT獲得EGFR-TKIs耐藥 腫瘤細胞EMT過程同樣也受到表觀遺傳的復雜調控，包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA等，而不同調控方式之間、甚至各種調控分子之間，都是有著相互關系的。

2.3.1 DNA甲基化 研究[23]發(fā)現，內皮素（endoglin）啟動子甲基化可沉默其表達，進而誘導EMT的發(fā)生。Shien等[24]研究發(fā)現，在發(fā)生EMT現象的耐藥細胞株中，miRNA-200c存在DNA甲基化現象，且甲基化后其表達下調，而Hashida等[25]通過進一步的研究發(fā)現，miRNA-200c DNA甲基化發(fā)現的部位是在啟動子區(qū)域。

2.3.2 組蛋白翻譯后修飾（乙?；?、甲基化） Peinado等[26]實驗證實，在小鼠細胞中Snail可募集HDACs，并與HDACs蛋白質N末端的SNAG結構域結合，從而對CDH1啟動子區(qū)的組蛋白進行修飾，并抑制其轉錄，此外，ZEB1也可協(xié)同組蛋白去乙酰化酶SIRT1使CDH1啟動子區(qū)的H3組蛋白去乙?；瘉硪种妻D錄過程。Tang等[27]發(fā)現，profilin-2通過C端互作，可影響HDAC1核轉位，減少其在Smad2和Smad3啟動子區(qū)域的募集，進而激活TGF-β1/Smad信號通路，誘導EMT。Chen等[28]發(fā)現，H3R2me1被PRMT5甲基化后，可通過募集WDR5激活EMT相關基因的轉錄，且和H3K4甲基化有協(xié)同作用，而H4R3me2s被PRMT5甲基化后，相關基因座的轉錄則明顯受到抑制。而去甲基化也在EMT過程中發(fā)揮了一定的作用，去甲基酶LSD1通過其胺氧化酶結構域，來催化甲基化組蛋白N末端的生物胺的氧化，進而抑制基因的表達。

2.3.3 非編碼RNA（miRNA, lncRNA） Park等[16]發(fā)現，在NSCLC中，CRIPTO1在miR-205調控參與下可激活ZEB1，誘導EMT，繼而產生EGFR-TKIs耐藥現象。Kitamura等[29]研究發(fā)現，MiR-134/487b/655復合物可通過調節(jié)TGF誘導出EMT相關的EGFR-TKIs耐藥。而MiR-154則可直接與3’-UTR結合下調ZEB2基因表達進而抑制EMT轉化[30]。Lee等[31]也發(fā)現miR-147可通過逆轉EMT來恢復細胞對EGFR-TKIs藥物的敏感性。而Garofalo等[32]發(fā)現MET可通過miR-103、miR-203下調，miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c的上調誘導EMT以及吉非替尼耐藥，另外研究發(fā)現miRNA-200可下調ZEB1/2的表達，且ZEB1/2也可反過來下調miRNA-200家族，在miRNA-200家族和ZEB1/2之間形成一個互反饋回路。

Pan等[33]研究發(fā)現，NSCLC細胞中，LncR NA BC087858可通過上調ZEB1和Snail的表達來調控EMT相關的非T790M突變EGFR-TKIs耐藥。而Cheng等[34]將非T790M突變型吉非替尼耐藥細胞株中的UCA1沉默后發(fā)現，細胞在EMT過程受限的同時，還重獲了對吉非替尼的敏感性，由此他們推測，lncRNA UCA1也參與了EMT介導的EGFR-TKIs耐藥過程。

3 結語

越來越多的研究表明，EMT與NSCLC獲得EGFRTKIs耐藥之間存在緊密聯(lián)系，腫瘤微環(huán)境中的間質細胞或細胞因子、異常信號通路以及組蛋白修飾、非編碼RNA等表觀遺傳均在耐藥相關的EMT表型變化中發(fā)揮作用。深入地探究腫瘤發(fā)生EMT的特征、功能改變及其機制，將為EGFR-TKIs耐藥的研究提供新方向和新治療靶點。