TLR4介導(dǎo)中藥干預(yù)腦缺血炎癥損傷的研究進(jìn)展*

岳少乾，孫作艷，李 霖，張翕婷，朱金墻，張 晗

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

炎癥反應(yīng)是參與腦缺血損傷的重要病理機(jī)制，而缺血區(qū)恢復(fù)血流有加劇腦缺血損傷的風(fēng)險，導(dǎo)致腦缺血區(qū)炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)。Toll樣受體4（TLR4）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達(dá)，腦缺血損傷后多種內(nèi)源性配體釋放，激活TLR4，隨后激活的TLR4通過信號級聯(lián)傳導(dǎo)，激活轉(zhuǎn)錄因子:核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、激活劑蛋白-1（AP-1）、干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）從而產(chǎn)生多種炎癥因子、Ⅰ型干擾素(IFN)，減輕或進(jìn)一步加重缺血損傷[1]。近年研究表明,中藥由于多成分、多途徑、多靶點的作用特點，使其可以抑制TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中多個信號蛋白分子，從而有效抑制腦缺血損傷過程中的炎癥反應(yīng)。

1 TLR4簡介

Toll樣受體4（TLR4）是參與固有免疫反應(yīng)的重要的模式識別受體蛋白，為Toll樣受體（TLRs）家族中的基礎(chǔ)成員，通過識別病原體相關(guān)分子模式配體（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式配體(DAMPs)并與之結(jié)合，從而觸發(fā)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答機(jī)制。能夠被TLR4識別的PAMPs包括來源于多種微生物（寄生蟲、細(xì)菌、真菌、病毒）的致病體，如脂類、脂蛋白、蛋白質(zhì)、和核酸等；而DAMPs主要包括機(jī)體損傷后自身釋放的內(nèi)源性分子，如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）,熱休克蛋白等[2-6]。

2 TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以分為髓樣分化因子88（MyD88）依賴性和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）依賴性信號通路。作為第一個被認(rèn)定的TIR家族成員，MyD88被所有TLRs家族成員除ToLL校受體 3（TLR3）外所共有，并且通過激活 NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路而產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[7]。相反，TRIF僅作為TLR3、TLR4的募集蛋白，并且通過替代途徑激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3、NF-κB，隨后產(chǎn)生Ⅰ型IFN和炎性細(xì)胞因子[5]。通過TLR4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，需要MyD88和TRIF信號通路同時參與；而通過TLRs其他成員介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，只需要MyD88或者TRIF信號通路參與[3，5]，提示阻斷TLR4的募集蛋白 MyD88，TLR4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)就會被抑制。

3 TLR4與腦缺血炎癥損傷

腦缺血后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的內(nèi)源性配體以及外周產(chǎn)生通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性配體,被小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的脂多糖受體CD14和TLR4受體識別并結(jié)合,小膠質(zhì)細(xì)胞活化，隨后轉(zhuǎn)化為類似巨噬細(xì)胞形態(tài)和功能的特異性小膠質(zhì)細(xì)胞，一方面釋放細(xì)胞毒性（細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子、趨化因子、一氧化氮、活性氧、前列腺素）或神經(jīng)保護(hù)類細(xì)胞細(xì)胞因子（腦源性神經(jīng)生長因子、促生長因子等），另一方面又能吞噬病變神經(jīng)元，從而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮免疫活性[6，8-12]；同時，星型膠質(zhì)細(xì)胞通過TLRs識別并結(jié)合內(nèi)源性配體而被激活,分泌各種炎癥因子包括:細(xì)胞因子、趨化因子、一氧化氮等[8]；兩者釋放的炎癥因子隨后又誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量細(xì)胞黏附分子，導(dǎo)致血液中的中性粒細(xì)胞浸潤于缺血區(qū)域腦組織，進(jìn)一步激活膠質(zhì)細(xì)胞。而神經(jīng)元，一方面受膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子的影響，加重自身損傷，另一方面又通過自身TLRs識別并結(jié)合內(nèi)源性配體，釋放多種炎癥因子[8,12]。最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)，進(jìn)一步加重腦缺血損傷。

4 中藥調(diào)控TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑減輕腦缺血炎癥損傷

4.1 中藥通過 TLR4/NF-κB途徑減輕炎癥反應(yīng) TLR4主要通過MyD88和TRIF途徑激活NF-κB。一方面，MyD88 N末端死亡結(jié)構(gòu)域白介素（IL）-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員之間的相互作用；IRAK4最先被激活，隨后誘導(dǎo)IRAK1的磷酸化，磷酸化的IRAK4、IRAK1從MyD88內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域分離并且和E3泛素連接酶-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）相互作用，被激活的TRAF6和E2、Ubc13、Uev1A共同促進(jìn)TRAF6本身和NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白（NEMO）63位賴氨酸的泛素化；隨后泛素化的TRAF6和NEMO募集蛋白激酶轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1（TAK1）、轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1結(jié)合蛋白（TAB）,最終 IκB 激酶（IKK）的 β 亞基被激活，使IκB-α32、36 和 IκB-β19、23 位絲氨酸 N-末端發(fā)生磷酸化，隨后發(fā)生泛素化，最終降解并且暴露出P65的核定位序列，隨即NF-κB在胞漿和細(xì)胞核穿梭的動態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致NF-κB主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，并與DNAκB序列結(jié)合，誘導(dǎo)包含κB序列的基因腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）、環(huán)氧化酶 2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-6（IL-6）等的轉(zhuǎn)錄，同時新合成的IκB-α蛋白又和細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB結(jié)合，形成IκB/NF-κB復(fù)合物而恢復(fù)原來的動態(tài)平衡[3，13-15]。另一方面，TRIF通過其N末端區(qū)域內(nèi)TRAF6結(jié)合序列直接與TRAF6結(jié)合，隨后TRAF6以MyD88途徑相似的方式激活TAK1；此外，TRIF又能夠通過C末端區(qū)域內(nèi)的受體反應(yīng)蛋白（RIP）同型作用序列與RIP1相互作用，RIP1多泛素化后與TRAF6和TAK1形成復(fù)合物，最終導(dǎo)致NF-κB經(jīng)典通路的激活[3，16]。

研究證實，中藥復(fù)方如補(bǔ)陽還五湯[17]，中藥有效成分如鉤藤堿、氧化苦參堿、甘草甜素、紫草素、藁本內(nèi)酯、葛根素、木犀草素、丹參酮ⅡA、黃連苷、薯蕷皂苷均能夠通過TLR4/NF-κB途徑減輕大腦中動脈阻塞（MCAO）模型中腦缺血損傷[17-28]。藁本內(nèi)酯主要通過抑制TLR4內(nèi)源性配體Prx6的釋放抑制TLR4/NF-κB途徑的激活，從而抑制炎癥因子TNF-α、白介素-β（IL-1β）、ICAM-1、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-17（IL-17）mRNA的表達(dá)和缺血區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞活化和白細(xì)胞浸潤，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。而薯蕷皂苷通過抑制HMGB-1的核移位抑制TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB途徑的激活，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、IFN-γ、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-α（MIP-1α）、MIP-2、IL-17、IL-23mRNA 的表達(dá)，從而發(fā)揮其保護(hù)作用；隨后通過培養(yǎng)PC12細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元，結(jié)果相似，證明薯蕷皂苷潛在作用靶點在神經(jīng)元。異槲皮素、黃芩苷均能在神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）損傷條件下，通過 TLR4/NF-κB途徑抑制神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)[29-30]。楊興旺等[31]研究紅花黃色素對小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)通路的影響，發(fā)現(xiàn)可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路而發(fā)揮抗炎作用。

4.2 中藥通過TLR4/AP-1途徑減輕炎癥反應(yīng) TLR4通過MyD88激活I(lǐng)KK，同時MAPK被激活；首先，胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）誘導(dǎo)高遷移率蛋白TCFs磷酸化，導(dǎo)致c-Fos表達(dá)增加，隨后c-Fos和轉(zhuǎn)錄因子MEF2誘導(dǎo)c-Jun表達(dá)；由Fos蛋白中亮氨酸鏈構(gòu)成的α螺旋結(jié)構(gòu)和有相似結(jié)構(gòu)的Jun蛋白構(gòu)成的AP-1二聚體隨之增加；胞內(nèi)糖原合酶激酶-3β和核糖體S6激酶2大量存在時，使Fos蛋白和Jun蛋白發(fā)生磷酸化，最終AP-1被激活，移位入核與DNA上AP-1區(qū)域結(jié)合，調(diào)控一些炎癥因子的表達(dá)，如:ICAM-1、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）[32-33]。

研究顯示，木犀草素[24-25]、藁本內(nèi)酯[22]、薯蕷皂苷[28]均能夠通過TLR4/AP-1途徑減輕中腦動脈閉塞（MCAO）模型中腦缺血損傷。木犀草素主要通過TLR4/ERK、P38途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。藁本內(nèi)酯主要通過Prx6/TLR4/ERK途徑發(fā)揮作用。薯蕷皂苷通過HMGB-1/TLR4/MyD88/TRAF6/MAPKs（ERK、JNK、P38）/AP-1途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷作用，隨后體外培養(yǎng)神經(jīng)元進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相似。同樣，異槲皮素也能在神經(jīng)元OGD/R損傷條件下，通過TLR4/P-38、P-JNK、P-ERK途徑抑制神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)[29]。

4.3 中藥通過TLR4/IRF3途徑減輕炎癥反應(yīng) TLR4通過TRIF依賴性途徑激活I(lǐng)RF3，從而產(chǎn)生Ⅰ型IFN[3]。TLR4首先通過MyD88依賴性途徑誘導(dǎo)早期NF-κB和MAPK活化，隨后通過內(nèi)吞途徑傳遞到細(xì)胞囊泡內(nèi)，與囊泡內(nèi)TRAM和TRIF組成復(fù)合物，該復(fù)合物通過募集TRAF3和TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和IKKi，催化IRF3磷酸化，形成IRF3二聚體，移位至細(xì)胞核，最終產(chǎn)生Ⅰ型IFN[34]。

Waleed等[20]研究甘草甜素對MCAO小鼠的保護(hù)作用時發(fā)現(xiàn)，甘草甜素可以抑制腦缺血導(dǎo)致的TLR4、TRIF、IRF3mRNA表達(dá)的升高，提示甘草甜素可以通過TLR4/TRIF/IRF3途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

5 總結(jié)與展望

近些年，以TLR4為靶點治療腦缺血損傷的研究備受研究者們的關(guān)注。筆者僅以TLR4在腦缺血損傷過程中的作用以及中藥的干預(yù)作以上總結(jié)，旨在為減輕腦缺血損傷基于TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抗炎療法提供參考。

在TLRs家庭中，中藥的作用靶點研究主要集中于TLR4，一方面，TLR4作為TLRs家族中的基礎(chǔ)成員，TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)幾乎可以反映整個TLRs家族介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的過程；另一方面，TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，需要MyD88和TRIF信號通路共同參與，通過阻斷MyD88 N末端死亡結(jié)構(gòu)域IRAK蛋白激酶家族成員之間的信號傳導(dǎo)，就可以抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的整個過程；因此，以TLRs為作用靶點，研究中藥抗腦缺血炎癥損傷意義重大。

通過TLR4干預(yù)腦缺血損傷的中藥有效成分主要包括:生物堿類、黃酮類、皂苷類、揮發(fā)油類。提示在今后以TLR4為靶點治療腦缺血損傷的研究中可以主要從以上4類成分中篩選出中藥活性成分。

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