黃丹化瘀飲對大鼠腦缺血再灌注損傷及腦組織BDNF、VEGF表達的影響

魯利甫，邱雪銀

（1.河南省濮陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，濮陽 457000；2.河南省濮陽市人民醫(yī)院腫瘤科，濮陽 457000）

缺血性腦血管疾病是因腦血管病變致使血流減少或中斷，使血管供應區(qū)出現(xiàn)缺血缺氧情況，出現(xiàn)一些病理生理反應。缺血后最重要的代償機制就是促進損傷區(qū)的血管再生，搭建良好的側(cè)支循環(huán)。有研究證實[1-2]，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）在重建缺血性腦血管病變的微循環(huán)中作用重大，是腦缺血后使血管再生的調(diào)控中心。腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）在神經(jīng)生長因子的家族中代表性最強，當神經(jīng)元發(fā)生病變或損傷時，在神經(jīng)元及其膠質(zhì)細胞中會有BDNF大量表達，發(fā)揮支持、營養(yǎng)、再生等功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，均為健康雄性，SPF級，體質(zhì)量平均（224±16）g，動物合格證號為 SYXK（蘇）2013-0018，由南京正大天晴公司提供。

1.1.2 藥液 黃丹化瘀飲組方主要包括:黃芪、丹參、葛根、鉤藤各 30 g，川芎 10 g，三七粉 4.5 g。將中藥飲片浸泡30 min（蒸餾水），用文火煎煮15 min，煎煮3次后，煎煮藥液混合并過濾，過濾后的藥液分別濃縮為濃度為100%、200%、400%的黃丹化瘀飲（生藥含量分別 1、2、4 g/mL），儲于冰箱（4℃）中備用。

1.1.3 試劑與儀器 兔抗鼠VEGF一抗、BDNF一抗、VEGFR-1抗體、鼠抗兔二抗試劑盒均由武漢博士德公司提供；蛋白定量試劑盒（BCA）；ECL顯影液。自動脫水機，德國ASP200S；石蠟包埋機，德國EG1150H；冰箱，日本SANYO；圖文分析系統(tǒng)，德國。

1.2 方法

1.2.1 分組 實驗動物隨機分為5組（每組12只）:假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組（模型組）、小劑量組[7.20 g/（kg·d）]、中劑量組[14.40 g/（kg·d）]、大劑量組[28.80 g/（kg·d）]。劑量根據(jù)大鼠與人體的劑量折算[3]。假手術(shù)組、模型組用等體積蒸餾水代替。各組均術(shù)前7 d開始給藥（灌胃），每日1次，最后一次給藥1 h后，制備腦缺血模型（大腦中動脈）。

1.2.2 大鼠模型制備 制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，用Liu F[4]改良線栓法。具體方法:大鼠仰臥位固定，麻醉大鼠（用10%水合氯醛，劑量350 mg/kg），經(jīng)頸部正中切口將頸動脈三角暴露，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)及頸外動脈，將頸總動脈及頸外動脈結(jié)扎，在頸外動脈接近分叉的地方剪“V”形切口，用鈍性魚線線栓（賴氨酸包被、直徑0.26 mm）斜行插入，由頸內(nèi)動脈推進入大腦中動脈，遇到有阻力時止（約插入18～20 mm）。然后肌肉、皮膚縫合，術(shù)中大鼠肛溫（37.0±0.5）℃。假手術(shù)組不插線栓，其他組均此操作。

1.2.3 神經(jīng)功能評分檢測 根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分（ZeaLonga評分法）[4]（5分制）進行大鼠神經(jīng)功能評分:無神經(jīng)功能損傷的癥狀，為0分；對側(cè)前爪無法完全伸展，為1分；向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，為2分；向右側(cè)傾倒，為3分；意識喪失、不能自發(fā)行走，為4分。評分為1～3分的大鼠入組實驗。

1.2.4 腦梗死體積測定 大鼠腦缺血2 h后再灌注24 h，麻醉迅速取腦，速凍（-20℃）18 min后，將腦組織置入腦槽，隨腦組織冠狀面切成5片，并放入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC)2%的溶液中，避光置入水浴箱中（37℃）30 min。然后腦片放入多聚甲醛溶液（4%）中固定4～6 h，用數(shù)碼相機拍照，圖像分析系統(tǒng)計算梗死面積。

1.2.5 組織學檢查 在大鼠腦缺血2 h后進行再灌注，24 h后，水合氯醛（10%）麻醉，并迅速開胸，心臟用生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛灌注并固定，然后斷頭取腦，并置入同樣灌注液，在4℃的條件下固定1周，脫水透明浸蠟、包埋，HE染色、封片，并觀察（在光鏡下）。

1.2.6 免疫組織化法 取大鼠腦組織切片，根據(jù)試劑盒說明書嚴格操作，雙氧水（H2O2）（3%）室溫孵育，兔抗鼠VEGF、BDNF、VEGFR-1一抗工作濃度均為1∶200，然后加二抗，蒸餾水沖洗，復染（蘇木素）、分化（鹽酸乙醇）、脫水（乙醇）、透明（二甲苯）、封片（中性樹膠），顯微鏡下觀察。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測 取缺血側(cè)的大腦皮質(zhì)，提取蛋白，BCA法對蛋白濃度進行測定。蛋白變性后，電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜并封閉，然后分別加入一抗（VEGF、BDNF、VEGFR-1均為1∶1 000；β-actin 為 1∶2 000），在 4 ℃下孵育過夜。羊抗兔二抗（1∶2 000，HRP 標記），室溫孵育，增強化學發(fā)光法（ECL）顯色，凝膠成像、顯影。Western blot條帶灰度值用Image J圖像分析系統(tǒng)，結(jié)果為VEGF、BDNF、VEGFR-1和β-actin的灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用重復測量的單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評分及梗死體積分析 模型組腦缺血再灌注24 h后腦梗死體積及神經(jīng)功能評分與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中劑量組、大劑量組腦梗死體積及神經(jīng)功能評分與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；小劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1，圖1。

表1 各組神經(jīng)功能評分及梗死體積分析（±s）

表1 各組神經(jīng)功能評分及梗死體積分析（±s）

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 神經(jīng)功能評分（分） 腦梗死體積所占比例（%）假手術(shù)組 12 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 12 2.42±0.58* 40.25±1.51*小劑量組 12 2.12±0.35 38.15±1.47中劑量組 12 1.66±0.25# 28.25±0.88#大劑量組 12 1.42±0.20## 23.47±0.52##

2.2 各組腦缺血組織VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達分析 模型組VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中劑量組、大劑量組VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；小劑量組與模型組比較，VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2，圖 2，圖 3，圖 4。

表2 各組腦缺血組織VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達分析（±s）

表2 各組腦缺血組織VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表達分析（±s）

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＞0.05，##P＜0.05。

VEGFR-1蛋白表達（VEGFR/β-actin）假手術(shù)組 12 0.41±0.01 0.83±0.02 0.40±0.02模型組 12 0.52±0.02* 1.03±0.35* 0.60±0.01*小劑量組 12 0.51±0.02# 1.20±0.25# 0.67±0.12#中劑量組 12 0.74±0.02## 1.59±0.23## 0.80±0.11##大劑量組 12 0.88±0.03## 1.62±0.24## 0.89±0.13##組別 n VEGF蛋白表達（VEGF/β-actin）BDNF蛋白表達（BDNF/β-actin）

3 討論

圖1 各組腦梗死再灌注24 h后TTC染色情況，深色為正常腦組織，淺色為梗死組織

圖2 各組腦缺血組織VEGF蛋白表達（immunohistoche-mistry，×400）

圖3 各組腦缺血組織BDNF蛋白表達（immunohistoche-mistry，×400）

圖4 各組腦缺血組織VEGFR-1蛋白表達（immunohistoche-mistry，×400）

黃丹化瘀飲為本院多年總結(jié)出的治療缺血性腦血管病的中藥方劑，其由黃芪、丹參、鉤藤、三七、川芎、葛根等草藥組成，主要通過活血、益氣、化瘀等發(fā)揮腦缺血損傷的治療作用[5]。趙志敏等[6]現(xiàn)代藥理證實，三七中的三七總皂苷能明顯使缺血再灌注大鼠腦組織BDNF蛋白合成明顯增加，上調(diào)BDNF mRNA的含量。丹參中的丹參酮ⅡA能明顯降低局部腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，也有研究證明其能夠上調(diào)人CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輔激活因子1（TORC1-CREB）信號通路，增強相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)某些神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，調(diào)節(jié)神經(jīng)元損傷后再生等[7-8]。本研究結(jié)果顯示，黃丹化瘀飲中劑量、大劑量組大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死面積均明顯低于模型組，由此提示此湯劑的有效性。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠缺血再灌注損傷后，VEGF蛋白表達明顯高于假手術(shù)組，這是機體對抗腦組織損傷自身保護的一種方式，與模型組比較，中劑量組及大劑量干預后，能明顯上調(diào)BDNF、VEGF表達，從而發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用[9-10]。本研究結(jié)果還顯示，中劑量組及大劑量干預后，使VEGFR-1表達也明顯升高，這說明中、大劑量黃丹化瘀飲促進VEGF蛋白表達的同時，也能夠上調(diào)其受體表達來促進缺血區(qū)的血管生成。此結(jié)果和劉秀萍[11]的研究不同，分析其原因，可能是因為研究缺血再灌注時間不同所致（本研究選取時間點為缺血2 h/再灌注24 h，劉秀萍[11]的研究選取時間點為缺血2 h/再灌注12 h，藥物促進VEGFR-1表達作用可能還沒有充分顯現(xiàn)出來）。

黃丹化瘀飲用于腦缺血再灌注后腦損傷模型大鼠，能通過上調(diào)VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用。不足的是，本研究是多種中藥方劑，對具體藥物的具體成分發(fā)揮的上調(diào)VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白水平的作用仍需進一步研究。

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