CRISPR/Cas9在相關(guān)皮膚病及基因治療中的研究進(jìn)展

支大龍 王剛

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院

近年來，隨著生物技術(shù)突破性的變革以及科學(xué)家們的不斷探索，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，推動著基因編輯的發(fā)展。傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)是以同源重組為基礎(chǔ)對基因進(jìn)行修飾，但由于構(gòu)建復(fù)雜、效率低，使其應(yīng)用受限。尋找新型、簡易、高效的基因組編輯技術(shù)成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的新熱點。人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)通常是指利用人工核酸酶靶位點特異性形成DNA雙鏈斷裂，引起DNA的修復(fù)機(jī)制，從而達(dá)到基因修飾的目的，主要有以下3種：鋅指核酸酶、類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。與傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)不同，人工核酸酶技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶對目的基因進(jìn)行切割，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)其產(chǎn)生修復(fù)機(jī)制，從而實現(xiàn)基因組的定點編輯。

CRISPR/CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）9系統(tǒng)是第3代基因編輯技術(shù)，相較于其他基因組編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建簡易，耗時短，切割效率更高，且適用于多基因同時編輯。該技術(shù)憑借其獨特優(yōu)勢，在一系列基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，如艾滋病、腫瘤、杜氏肌營養(yǎng)不良癥等多種疾病。CRISPR/Cas9系統(tǒng)最初在原核生物中發(fā)現(xiàn)，參與免疫抵御，使宿主獲得抵抗噬菌體、質(zhì)粒等外源物質(zhì)入侵的免疫能力。從Mali等［1］首次利用該系統(tǒng)實現(xiàn)基因組的編輯至今，其在包括斑馬魚［2］、大鼠［3］、小鼠［4］、非人靈長類［5］等許多物種中實現(xiàn)基因組的靶向編輯，很大程度上推動了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)程。本文主要綜述CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究歷史、主要構(gòu)成、作用機(jī)制及其在基因治療中的應(yīng)用等。

一、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究歷史、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及作用機(jī)制

1.研究歷史：1987年，Ishino等［6］首次發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌基因組中存在一連串短的空間間隔重復(fù)序列，這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時并沒有引起科研工作者的足夠關(guān)注。2000年，Mojica等［7］將此類成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列稱為成簇的重復(fù)元件，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該元件存在于40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中。2002 年，Coffey 和 Ross［8］將其正式命名為CRISPR。2005年，Mojica等［9］發(fā)現(xiàn)，在重復(fù)序列附近存在許多Cas的保守基因，并根據(jù)Cas基因不同將CRISPR系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。2013 年，Mali等［1］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠基因組進(jìn)行編輯，自此，CRISPR/Cas9開始作為一種新的基因組編輯技術(shù)。在基因功能、基因治療以及構(gòu)建疾病動物模型等相關(guān)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛使用。

2.結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：CRISPR/Cas系統(tǒng)由多個重復(fù)序列（repeats）與非重復(fù)間隔序列（spacers）構(gòu)成的R?S結(jié)構(gòu)及編碼Cas的基因操縱子組成，其中R?S結(jié)構(gòu)能夠特異性識別外源性DNA，并由類似于啟動子的CRISPR前導(dǎo)序列起始轉(zhuǎn)錄生成CRISPR RNA前體。Cas基因家族負(fù)責(zé)編碼具有多種功能的CRISPR相關(guān)蛋白，成熟CRISPR RNA由轉(zhuǎn)錄形成的CRISPR RNA前體與相關(guān)Cas蛋白的作用產(chǎn)生，并與tracrRNA協(xié)同作用，共同構(gòu)筑細(xì)菌的免疫屏障。2011年，Wiedenheft等［10］將CRISPR/Cas9系統(tǒng)CRISPR RNA與反式激活crRNA的二聚體結(jié)構(gòu)簡化為單鏈向?qū)NA與Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，介導(dǎo)Cas9蛋白與目的基因結(jié)合并切割。

3.作用機(jī)制：CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制分為3個階段，即獲取CRISPR間隔序列、轉(zhuǎn)錄CRISPR RNA前體和加工CRISPR RNA、CRISPR RNA與反式激活crRNA及Cas9蛋白結(jié)合成復(fù)合體對外源性DNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。此外，原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif）也是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的重要部分，為CRISPR基因座中一段高度保守序列（5′?NGG?3′）。 CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割DNA后會使其雙鏈斷裂，引起DNA修復(fù)機(jī)制，實現(xiàn)基因編輯。DNA雙鏈斷裂會發(fā)生兩種修復(fù)模式：外源同源重組模板不存在時，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生非同源末端連接修復(fù)插入或缺失，導(dǎo)致移碼突變；外源同源重組模板存在時，可能會在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組修復(fù)。

二、CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療中的應(yīng)用

基因治療指利用基因組編輯技術(shù)將致病基因糾正為正?；?，從而實現(xiàn)疾病的治療。傳統(tǒng)的基因治療難以將致病基因精準(zhǔn)替換為正?；?，且可能會在生物體內(nèi)殘留外源物質(zhì)，對機(jī)體產(chǎn)生不良作用。目前的研究思路主要有：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將顯性致病基因切除；利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對將引起遺傳病的功能基因進(jìn)行切割，并引入正常的功能基因；利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用多個單鏈向?qū)NA同時對多個致病基因切除，獲得療效。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可直接用于體細(xì)胞定向基因編輯，將細(xì)胞在體外進(jìn)行定向編輯，再輸入患者體內(nèi)，達(dá)到治療作用。

1.疾病動物模型：2013年，Yang等［4］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次在小鼠中實現(xiàn)Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty多基因同時靶向編輯。2014年，Niu等［5］首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對食蟹猴基因組進(jìn)行精確修飾。由于非人靈長類在生理生化、遺傳背景等方面與人類高度相似，因此建立非人靈長類疾病動物模型對于研究多基因控制的復(fù)雜疾?。ㄈ缗两鹕喜。┯蟹浅Ｖ匾囊饬x。2015年，Zhou等［11］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除豬胎兒成纖維細(xì)胞酪氨酸酶基因，然后通過體細(xì)胞核移植技術(shù)得到成活的酪氨酸酶基因敲除豬，該動物模型有明顯的白化表型。這些研究為遺傳病和代謝病等的治療提供了較好的動物模型。

2.與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）技術(shù)共同用于基因治療：iPS指具有多向分化潛能以及自我再生能力的多能細(xì)胞，在疾病治療和疾病模型構(gòu)建等相關(guān)研究中有重要意義。隨著基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于修飾iPS基因組。

2014年，Xie等［12］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功修復(fù)了地中海貧血癥患者iPS的致病基因β珠蛋白基因，并將修復(fù)后的iPS細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)分化為正常紅細(xì)胞，為地中海貧血癥提供了新的治療方法。2015年，Howden等［13］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對兩名分別患有色素性視網(wǎng)膜炎和重癥聯(lián)合免疫缺陷的患者成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，在矯正致病基因PRPF8和ADA的同時進(jìn)行重編程形成iPS，將其分化為目的細(xì)胞，該研究極大地縮短了遺傳性修復(fù)干細(xì)胞的獲取時間，為干細(xì)胞靶向療法提供新思路。

3.腫瘤治療研究：目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已應(yīng)用在腫瘤研究的諸多方面。2014年，Zhen等［14］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立了針對引發(fā)宮頸癌的人乳頭瘤病毒特異表達(dá)的E6和E7基因的編輯系統(tǒng)，并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入感染人乳頭瘤病毒的宮頸癌細(xì)胞，細(xì)胞的增殖速率明顯減緩。嵌合抗原受體T細(xì)胞是一類經(jīng)過改造且能夠特異性殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞。2017年，Liu等［15］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除嵌合抗原受體T細(xì)胞T細(xì)胞受體、人內(nèi)源性微球蛋白及細(xì)胞程序化死亡受體1基因，發(fā)現(xiàn)與正常嵌合抗原受體T細(xì)胞相比，敲除上述基因的T細(xì)胞在體外及體內(nèi)具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷功能。同年，Chen等［16］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將致死基因敲入癌細(xì)胞的融合基因，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，而這種融合基因只存在癌細(xì)胞，不存在于健康細(xì)胞，極大地提高了基因治療的特異性。

4.皮膚性病學(xué)領(lǐng)域：多種免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能紊亂，釋放大量炎癥細(xì)胞因子，使機(jī)體炎癥反應(yīng)加重，是有些皮膚?。ㄈ玢y屑病、大皰性類天皰瘡等）的可能發(fā)病機(jī)制之一，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用可為這類疾病發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供新思路。2015年，Shi等［17］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行全基因組篩查，證實半胱氨酸蛋白酶通過切割介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的底物蛋白控制炎癥壞死，而炎癥壞死是先天免疫系統(tǒng)對病原體產(chǎn)生的重要免疫反應(yīng)。2017年，Simeonov等［18］利用一種改進(jìn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)CRISPR activation（CRISPRa）成功地找到了調(diào)控免疫細(xì)胞發(fā)育的增強(qiáng)子，該序列對于自身免疫疾病的發(fā)生有重要作用。

也有科研人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)探討黑素瘤的發(fā)病機(jī)制和治療。2016年，Zhu等［19］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)篩選11個lncRNA位點，成功篩選出正向及負(fù)向調(diào)控人黑素瘤細(xì)胞增殖的lncRNA。2017年，Manguso等［20］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除黑素瘤細(xì)胞中多個表達(dá)基因，進(jìn)一步驗證細(xì)胞程序性死亡配體1和CD47兩個基因被刪除后癌細(xì)胞更容易受細(xì)胞程序性死亡配體1阻斷。

艾滋病是常見的性傳播疾病，由1型人免疫缺陷病毒（HIV?1）損傷人T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能紊亂所致。近來，隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不斷發(fā)展，研究人員嘗試?yán)迷撓到y(tǒng)抑制HIV?1在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，甚至敲除HIV?1基因片段。2014年，Hu等［21］在HIV?1 長末端重復(fù)序列?U3利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯，使得HIV?1在T細(xì)胞感染潛伏期中表達(dá)失活，同時設(shè)計多對單鏈向?qū)NA對宿主細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，將整合前病毒基因組中5′?3′長末端重復(fù)序列片段完全切除。2016年，Kaminski等［22］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在活體動物基因組中敲除HIV?1的一段序列，從而降低HIV?1的感染效率。2017年，Xu等［23］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變肝臟造血干細(xì)胞CCR5基因，在小鼠動物模型中證明該突變有一定抵抗HIV感染的效果。同年，Yin等［24］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)使HIV?1的復(fù)制功能喪失，從而使HIV?1從被感染的細(xì)胞中徹底清除。

5.其他：隨著對基因組編輯技術(shù)的深入研究，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也在不斷改進(jìn)并應(yīng)用于多個領(lǐng)域。2015年，Zetsche等［25］發(fā)現(xiàn)一種新型CRISPR系統(tǒng)CRISPR/Cpf1。與Cas9蛋白相比，Cpf1蛋白更小，更容易進(jìn)入細(xì)胞。此外，Cpf1在切割DNA后并不是形成Cas9切割后的平末端，而是形成黏性末端，使外源基因更容易插入，而且其識別位點與剪切位置相距較遠(yuǎn)，選擇編輯位置更加自由。同年，Ran等［26］在金黃色葡萄球菌中，發(fā)現(xiàn)一種新型Cas9酶SaCas9，與經(jīng)典SpCas9相比，其基因長度減少25%，且可被裝載入腺相關(guān)病毒而不影響其包裝和活力，因此，提供了一個方便有效的在體基因操作工具。2017年，Kim等［27］設(shè)計出CjCas9并通過腺相關(guān)病毒將其轉(zhuǎn)入小鼠肌細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，將黃斑變性相關(guān)的兩個基因血管內(nèi)皮生長因子A和血管內(nèi)皮生長因子A轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子1a敲除，從而減少脈絡(luò)膜新生血管，為該病的治療提供新的選擇。單堿基基因編輯技術(shù)是在CRISPR/Cas9系統(tǒng)基礎(chǔ)之上對Cas9蛋白進(jìn)行改造，實現(xiàn)不依賴于DNA斷裂而能夠?qū)NA四種堿基A、T、G、C進(jìn)行替換的編輯技術(shù)，該技術(shù)極大地提高了基因的精確修復(fù)效率［28?29］。

三、目前存在的問題及應(yīng)用前景

與其他基因組編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有許多優(yōu)勢。首先，其有更高的基因編輯效率；其次，CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別靶位點僅需關(guān)注原型間隔序列毗鄰基序區(qū)的3個堿基，構(gòu)建方便，簡單快捷［30］；最后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以同時編輯基因組中多個基因位點，可在研究由多基因突變引起的復(fù)雜疾病中發(fā)揮重要作用。

作為一種革命性技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍存在不足，其中脫靶效應(yīng)一直是該技術(shù)需要克服的重大技術(shù)問題。2016年，Doench等［31］對單鏈向?qū)NA結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶率大幅降低。同年，Ran等［32］將單鏈向?qū)NA 5′端的互補(bǔ)序列減少，由17或18個互補(bǔ)的核苷酸組成，這與未減短的單鏈向?qū)NA打靶活性相同，提高了單鏈向?qū)NA配對靶位的敏感性，同時降低了脫靶位點引起的突變效應(yīng)。另外，優(yōu)化Cas9蛋白結(jié)構(gòu)也可降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效率。2016年，Kleinstiver等［33］通過改造高保真SpCas9蛋白使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效率顯著降低，而打靶效率并未受此影響。2015年，Slaymaker等［34］通過改造Cas9酶的3個氨基酸位點，極大降低了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)。2017年，Chen等［35］突變Cas9中REC3的氨基酸殘基，在減少脫靶效率的同時保持高效的敲除效率。另外，基因復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制以及功能多樣性使CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在不可預(yù)知的風(fēng)險，在基因編輯之前必須明確所敲除基因的功能作用，以避免出現(xiàn)在編輯致病基因的同時增加其他疾病的患病風(fēng)險。與體細(xì)胞編輯相比，生殖細(xì)胞的基因編輯在影響個體的同時也對后代產(chǎn)生影響，進(jìn)而可能改變其物種遺傳軌跡。

隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)不斷的發(fā)展和完善，CRISPR/Cas9系統(tǒng)自身存在的一些局限性將不斷被克服，相信在不久的將來該系統(tǒng)可以為基礎(chǔ)研究、疾病預(yù)防和治療等提供更加高效簡單的方案。