小規(guī)模多中心骨質(zhì)疏松生物樣本庫的構(gòu)建及應(yīng)用探索研究

李英華 鹿彤 施曉軍 陳飛 胡曉暉 崔云卿 楊恭 洪洋*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院，上海 200240 2. 上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 201999 3. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院，上海 200125

隨著老齡化社會的到來，具有高發(fā)性和嚴(yán)重危害性特點(diǎn)的老年性骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響了老年人群的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為一個(gè)重要的社會公共衛(wèi)生問題[1]。因此，骨質(zhì)疏松的診斷、治療、預(yù)防無疑成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，各國政府和衛(wèi)生部門都投入了相當(dāng)大的人力、物力和財(cái)力，從基礎(chǔ)到臨床，從環(huán)境營養(yǎng)到人體遺傳，從不同種族到同種族的不同群體，從西醫(yī)到中醫(yī)再到中西醫(yī)結(jié)合都進(jìn)行了廣泛而深入的研究[2-9]。雖然科研工作者們對骨質(zhì)疏松的各種方面進(jìn)行了大量研究，但迄今為止，關(guān)于骨質(zhì)疏松生物樣本庫的建立尚處于起步階段，我國仍舊缺乏高質(zhì)量的骨質(zhì)疏松生物樣本庫，嚴(yán)重限制了骨質(zhì)疏松相關(guān)研究的發(fā)展。一個(gè)高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的生物樣本庫可以為醫(yī)學(xué)研究提供穩(wěn)定可靠的樣本資源，是研究成果快速轉(zhuǎn)化應(yīng)用到臨床、實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要保障[10]。因此上海市第五人民醫(yī)院聯(lián)合上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院、上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院建立了高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、信息化的多中心骨質(zhì)疏松生物樣本庫?，F(xiàn)對小規(guī)模多中心標(biāo)準(zhǔn)化的骨質(zhì)疏松樣本庫的建立和應(yīng)用進(jìn)行報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象來自常住上海市的40～70歲的社區(qū)體檢居民。入組前簽署知情同意書并通過復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院倫理委員會的審查。樣本共收集5000例，目前已有2600例，其中女性1968例，男性732例，平均年齡(62.43±6.74)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡40～70歲的住上海5年以上的居民；(2)愿意接受10年以上長期隨訪且愿意配合采集空腹血樣、尿樣的體檢人群；(3)能夠理解并配合完成調(diào)查問卷的人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝、腎、內(nèi)分泌等急慢性疾病人群；(2)在本研究開始之前6個(gè)月內(nèi)曾使用抗骨質(zhì)疏松藥物(如雌激素、降鈣素、二膦酸鹽、鈣制劑等)；(3)影響骨代謝的惡性腫瘤疾病患者。

1.2 方法

1.2.1一般人口學(xué)資料及流行病學(xué)資料庫的建立：在調(diào)查問卷中設(shè)計(jì)一般人口學(xué)資料、疾病史、飲食習(xí)慣、運(yùn)動習(xí)慣、睡眠習(xí)慣、精神因素以及女性針對因素調(diào)查。人口學(xué)資料包括姓名、性別、出生年月、民族、文化程度、身高、體重、職業(yè)、居住地址、自己的聯(lián)系方式、親屬的聯(lián)系方式等；疾病史資料包括既往史、家族史、服藥史、手術(shù)史和結(jié)石史等。運(yùn)動習(xí)慣資料包括周運(yùn)動時(shí)長、運(yùn)動強(qiáng)度和運(yùn)動方式。飲食習(xí)慣資料包括飲食組成、吸煙情況、飲酒情況、飲料攝入情況。睡眠習(xí)慣資料包括睡眠總時(shí)長、入睡時(shí)間、入睡所需時(shí)長、睡眠質(zhì)量、睡眠規(guī)律性、睡眠手機(jī)關(guān)機(jī)情況。精神因素資料包括是否有安全感、是否經(jīng)常郁悶、對人際關(guān)系是否滿意、遇事是否容易緊張等情況。女性針對因素資料包括初潮年齡、絕經(jīng)年齡、妊娠情況、產(chǎn)子情況及哺乳史情況。

1.2.2骨密度數(shù)據(jù)庫的建立：對具有完整調(diào)查問卷的人群資料的人群采用GE Lunar Prodigy雙能射線骨密度儀測定腰椎(L1～4)、髖部、股骨頸和Ward’s三角區(qū)的骨密度，并計(jì)算相應(yīng)的Z值和T值。根據(jù)中國老年學(xué)和老年醫(yī)學(xué)學(xué)會骨質(zhì)疏松委員會制定的骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)，以相對于我國常模同一性別的骨密度平均(T分值)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，并以腰椎、髖部和Ward’s三角區(qū)任何一部位T值<-2.5SD(標(biāo)準(zhǔn)差)為骨質(zhì)疏松，-2.5SD

1.2.3生物樣本的收集：生物樣本包括空腹血的血清、血漿、白細(xì)胞、尿液及DNA。有流行病學(xué)調(diào)查問卷、骨密度數(shù)據(jù)的志愿者在采集生物樣本前控制清淡飲食、限制營養(yǎng)補(bǔ)充劑2 d后空腹真空靜脈采集促凝血5 mL，抗凝血7 mL，尿液15 mL。室溫靜置30 min后，4 ℃低溫3500 rpm離心10 min，分離血清、血漿一式5份儲存于0.5 mL EP管中，白細(xì)胞一式兩份，一份儲存于EP管中，一份用于DNA提取后進(jìn)行基因分型。尿液1500 rpm離心10 min，一式5份儲存于1.5 mL EP管中。分裝完畢的生物樣本和調(diào)查問卷、骨密度數(shù)據(jù)編制同樣的號碼放入-80 ℃冰箱進(jìn)行入庫保存，存放有效期8年。血液尿液生物樣本的采集周期和骨密度數(shù)據(jù)采集周期一致，具體為骨質(zhì)疏松人群每年采集一次，骨量減少人群 2～3年采集一次，骨量正常人群5年采集一次。在存放有效期到期時(shí)用新采集的生物樣本更替廢棄樣本。

1.2.4DNA的提取及其基因分型：將收集生物樣本時(shí)收集的白細(xì)胞層300 μL用紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5 min，期間用槍吹打3次，10000 rpm離心1 min，倒去上層液體，留下白細(xì)胞沉淀。采用天根DP304型號的離心柱法DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行DNA提取。將提取后的DNA一式3份分裝于500 μL的EP管中儲存于-80 ℃的冰箱中，和血清、尿液、血漿、白細(xì)胞、骨密度數(shù)據(jù)編制相同的編碼。

易感基因位點(diǎn)的篩選從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP中查詢骨質(zhì)疏松易感候選基因3’UTR、5’UTR或者3‘FLANK和5’FLANK的最小等位基因頻率大于5%的SNP位點(diǎn)，基因分型采用7900HT快速Real-Time PCR儀對選取的基因位點(diǎn)進(jìn)行分型，并將基因分型和骨密度及骨質(zhì)疏松的發(fā)病率情況進(jìn)行關(guān)聯(lián)，對與低骨密度值有相關(guān)性的基因型進(jìn)行優(yōu)勢比(OR值)分析，找出具有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的基因型[12]。

1.2.5數(shù)據(jù)管理、質(zhì)量控制及樣本應(yīng)用流程：數(shù)據(jù)管理采用萬格凍存管理軟件數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，使用條形碼管理生物樣本的入庫和出庫。生物樣本的DNA質(zhì)量和純度實(shí)行每年定期抽檢制度，蛋白質(zhì)、RNA完整性每半年定期抽檢，抽檢人員分為分中心質(zhì)檢人員和第三方權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)人員，采用紫外分光光度法和電泳法進(jìn)行質(zhì)量檢測。結(jié)果采用分中心質(zhì)檢結(jié)果和權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)質(zhì)檢結(jié)果進(jìn)行比對的方式進(jìn)行質(zhì)量核驗(yàn)。樣本使用流程采用申請人提出使用申請、倫理委員會倫理審查、樣本收集課題組使用合理性審查、多中心樣本學(xué)術(shù)委員會樣本使用科學(xué)性審查、組織樣本庫負(fù)責(zé)人出庫等幾個(gè)步驟。平臺樣本資源共享時(shí)樣本調(diào)用時(shí)采用干冰冷鏈運(yùn)輸使用方，骨密度數(shù)據(jù)和調(diào)查問卷采用定期掃描3次拷貝備份在各分中心數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松樣本庫的樣本及數(shù)據(jù)資料建設(shè)

從2014年1月開始籌建并進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及樣本采集工作，建立了包含流行病學(xué)調(diào)查問卷、骨密度數(shù)據(jù)、血液、尿液、DNA等生物樣本的首個(gè)上海市多中心骨質(zhì)疏松生物樣本庫。每個(gè)骨質(zhì)疏松志愿者的信息包括知情同意書的調(diào)查問卷一份，包含腰椎(L1～4)骨密度、股骨頸骨密度、Ward’s三角區(qū)骨密度和總髖骨密度及其T值和Z值的骨密度詳細(xì)數(shù)據(jù)資料一份，血清5份、血漿5份、白細(xì)胞1份、DNA 3份及部分骨質(zhì)疏松易感基因位點(diǎn)的基因型。生物樣本的人群為40～70歲的社區(qū)體檢居民，因此研究對象包括正常人群、骨量減少人群和骨質(zhì)疏松人群，可以用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防、診療和分子流行病學(xué)調(diào)查的橫斷面研究和前瞻性研究。

2.2 骨質(zhì)疏松樣本庫的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)

多中心在標(biāo)準(zhǔn)化方面采用與上海市第五人民醫(yī)院簽訂共建骨質(zhì)疏松生物樣本庫的合作合同后，由上海市第五人民醫(yī)院提供統(tǒng)一的倫理批件、統(tǒng)一的調(diào)查問卷、統(tǒng)一的入組及排除標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一的樣本采集器具、樣品處理按照統(tǒng)一的生物樣本采集及處理標(biāo)準(zhǔn)操作流程，生物樣本先期采用全程冷鏈運(yùn)輸，后期合作中心具有存儲條件后采取按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)操作培訓(xùn)的異地異庫儲存，異地質(zhì)檢的方式。骨密度數(shù)據(jù)統(tǒng)一性采用樣本庫參與建設(shè)的人作為模型進(jìn)行三方測定后進(jìn)行系數(shù)矯正。

2.3 骨質(zhì)疏松樣本庫的軟硬件及制度規(guī)程建設(shè)

骨質(zhì)疏松樣本庫的硬件主要為各色凍存盒、-80 ℃的冰箱、低溫離心機(jī)、掃碼打印機(jī)、溫控報(bào)警系統(tǒng)、調(diào)查問卷復(fù)印打印及掃描系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀等組成。制度主要包括科學(xué)技術(shù)保密規(guī)定制度、骨質(zhì)疏松生物樣本采集技術(shù)操作規(guī)程、骨質(zhì)疏松生物樣本處理技術(shù)操作規(guī)程、骨質(zhì)疏松生物樣本保存技術(shù)操作規(guī)程、超低溫冰箱管理制度、骨質(zhì)疏松樣本庫從業(yè)人員定期培訓(xùn)與測評制度、骨質(zhì)疏松生物樣本申請與審核制度、骨質(zhì)疏松信息和生物樣本定期核查制度。

2.4 骨質(zhì)疏松樣本庫的人員組織機(jī)構(gòu)建設(shè)和經(jīng)費(fèi)來源

骨質(zhì)疏松樣本庫的建設(shè)人員組成包括：流行病學(xué)調(diào)查人員1名、骨密度檢測人員1名、生物樣本采集人員2名、生物樣本運(yùn)輸人員1名、生物樣本處理人員2名、生物樣本信息管理員1名、生物樣本安全員2名、骨質(zhì)疏松隨訪人員2名、生物樣本開發(fā)利用人員3名。樣本庫的建設(shè)人員均為本院的在職在編人員，由本院核醫(yī)學(xué)科、檢驗(yàn)科、營養(yǎng)科、體檢科、骨科和中心實(shí)驗(yàn)室的正式工作人員組成。另外對應(yīng)骨質(zhì)疏松樣本庫的開發(fā)利用過程中需要樣本管理委員會、生物樣本學(xué)術(shù)委員會和倫理委員會的參與。樣本采集、處理及儲存人員具有生物相關(guān)專業(yè)本科以上學(xué)歷，受過生物樣本采集、處理及儲存專業(yè)訓(xùn)練，能夠保證生物樣本的安全和質(zhì)量。樣本管理委員會、生物樣本學(xué)術(shù)委員會和倫理委員會成員中必須有骨科相關(guān)背景的具有高級職稱或碩士以上學(xué)歷人員的參與，以保證相關(guān)樣本使用評價(jià)的科學(xué)性及可行性。樣本庫的經(jīng)費(fèi)來源先期由醫(yī)院自籌，衍生科研成果項(xiàng)目后由項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)支撐樣本庫的滾動發(fā)展。

3 討論

隨著骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)和臨床相關(guān)研究日益增多，如何能夠更科學(xué)有效地將研究轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床應(yīng)用技術(shù)是骨質(zhì)疏松從業(yè)人員關(guān)注的重點(diǎn)，骨質(zhì)疏松生物樣本庫的建立可以為骨質(zhì)疏松的分子流行病學(xué)調(diào)查、骨質(zhì)疏松的預(yù)防和診治提供良好的研究平臺。因此，高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；?、共享化的骨質(zhì)疏松生物樣本庫的建立有利于骨質(zhì)疏松疾病研究的發(fā)展。

隨訪中的失聯(lián)問題是骨質(zhì)疏松前瞻性樣本庫建立過程中遇到的最大問題。在前期建立過程中，由于志愿者更換手機(jī)或者留下的電話號碼不對的情況導(dǎo)致有20%左右的失聯(lián)率。為了保證減少隨訪過程中的失聯(lián)情況，在流行病學(xué)調(diào)查問卷設(shè)計(jì)聯(lián)系方式時(shí)，除志愿者本人外，設(shè)計(jì)有志愿者配偶、子女或者其他親屬的2～3個(gè)聯(lián)系方式，同時(shí)配合留微信、電子郵箱等方式。經(jīng)過聯(lián)系方式的改進(jìn)，骨質(zhì)疏松樣本庫隨訪率可達(dá)98%以上。

知情同意書的收集困難是骨質(zhì)疏松生物樣本庫建立過程中的另一大難題。由于生物樣本采集需要知情同意書的簽署，導(dǎo)致部分志愿者配合難度較大。把知情同意書置于流行病學(xué)調(diào)查問卷中，強(qiáng)化解釋調(diào)查問卷對今后骨質(zhì)疏松治療和預(yù)防的重要性，弱化知情同意書簽署效應(yīng)，可以提高志愿者的招募配合度及知情同意書的簽署率。

睡眠質(zhì)量是影響慢病的重要因素，前期研究也發(fā)現(xiàn)睡眠質(zhì)量評價(jià)分?jǐn)?shù)與骨質(zhì)疏松的發(fā)生率息息相關(guān)。因此，骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查因素設(shè)計(jì)時(shí)，建議將睡眠因素納入到骨質(zhì)疏松生物樣本庫的因素調(diào)查中，以便觀察睡眠質(zhì)量指數(shù)是否可以作為骨折風(fēng)險(xiǎn)因子納入到骨折風(fēng)險(xiǎn)評估工具中。

骨質(zhì)疏松生物樣本庫的開發(fā)利用模式是目前眾多骨質(zhì)疏松科研工作者關(guān)注的問題。骨質(zhì)疏松生物樣本庫的建設(shè)除具有服務(wù)社會、服務(wù)臨床和培養(yǎng)人才的三大功能外，更多的是可以服務(wù)于科研，為研究骨質(zhì)疏松新的治療預(yù)防措施提供樣本。經(jīng)過3年的骨質(zhì)疏松生物樣本的小規(guī)模利用，已經(jīng)初步探索出骨質(zhì)疏松樣本庫的開發(fā)利用模式：臨床血液樣本→DNA提取→候選基因單核苷酸多態(tài)性骨質(zhì)疏松新功能位點(diǎn)篩選→細(xì)胞、動物新功能基因的基礎(chǔ)作用機(jī)理研究→新靶點(diǎn)干預(yù)分子藥物或天然藥物尋找或者新診斷手段探索→新的臨床干預(yù)手段。這種開發(fā)利用模式為骨質(zhì)疏松樣本庫的開發(fā)利用提供了新的思路。

隨著生物樣本庫規(guī)模的擴(kuò)大和新的骨質(zhì)疏松中心的加入，骨質(zhì)疏松生物樣本庫不僅能滿足自身的教學(xué)、臨床和科研需要，還可以向各兄弟醫(yī)院、科研機(jī)構(gòu)和高等院校提供確診的、合乎科研要求的病例標(biāo)本和正常對照標(biāo)本，對促進(jìn)骨質(zhì)疏松的研究發(fā)展有著積極的意義。期待有更多的骨質(zhì)疏松生物樣本納入到多中心生物樣本庫來，實(shí)現(xiàn)同行之間的信息和資源共享，達(dá)到科學(xué)、統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化的骨質(zhì)疏松大數(shù)據(jù)資源共享。