牛胚胎回收和質(zhì)量評(píng)價(jià)

蔡世芹

（黑龍江省林口縣畜牧獸醫(yī)局157699）

1 胚胎回收

牛胚胎大約在靜立發(fā)情后約第4天進(jìn)入子宮，可在6～8d后回收胚胎，此時(shí)胚胎應(yīng)處于桑葚胚或早期囊胚階段，胚胎周圍仍有透明帶包被。在回收胚胎之前，可采用直腸觸診法檢查超排反應(yīng)效果，也可采用直腸內(nèi)超聲掃描來(lái)評(píng)估，后一種方法能更加準(zhǔn)確地估計(jì)黃體數(shù)量和未排卵的卵泡數(shù)，但難以估計(jì)黃體的準(zhǔn)確數(shù)量，特別是當(dāng)卵巢上有多個(gè)黃體存在時(shí)更為困難。如果只有一兩個(gè)黃體，或是有卵泡囊腫，建議不要回收。沖胚先對(duì)母牛進(jìn)行硬膜外麻醉，以阻止努責(zé)和排糞。沖胚過(guò)程中，應(yīng)對(duì)會(huì)陰部、陰唇內(nèi)部進(jìn)行清洗干凈，并用溫和的消毒劑仔細(xì)消毒，盡可能地減少污染非常重要。

最常用的采胚管是福利氏（Foley）橡膠導(dǎo)管，這種導(dǎo)管可經(jīng)直腸小心控制，由子宮頸導(dǎo)入子宮角的理想位置，當(dāng)導(dǎo)管尖部到達(dá)子宮角中部時(shí)，將氣囊中裝滿鹽水或空氣。應(yīng)注意在插入導(dǎo)管及充滿氣囊過(guò)程中切勿損傷子宮內(nèi)膜，否則會(huì)導(dǎo)致沖洗液回收不全或引起出血。如果出血，則隨后出現(xiàn)的血凝塊會(huì)干擾胚胎鑒定。在小母牛沖胚時(shí)可能有必要使用子宮頸開(kāi)張器，應(yīng)當(dāng)注意開(kāi)張器在進(jìn)入最后一個(gè)子宮頸環(huán)后不要穿入子宮。

兩個(gè)子宮角可分別進(jìn)行沖洗，或沖洗整個(gè)子宮體。常用的沖胚液一般為改良的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS），添加1～2%的牛血清白蛋白（BSA）或者犢牛血清（FCS）及各種抗生素。為了防止胚胎黏附到過(guò)濾器、培養(yǎng)皿和導(dǎo)管上，沖胚液中應(yīng)加入足夠的、沒(méi)有被病毒污染的蛋白質(zhì)。有兩種沖胚方法，即連續(xù)沖胚法，或用30～50ml沖胚液的注射-抽吸式重復(fù)間斷式?jīng)_胚法。所需沖胚液的量在不同動(dòng)物略有不同，每個(gè)子宮角約0.5L，經(jīng)產(chǎn)牛用量大些。不論采用哪種方法都要回收所有注入的沖胚液，因?yàn)槠渲锌赡軙?huì)有胚胎。

回收的沖胚液隨后轉(zhuǎn)入特殊設(shè)計(jì)的孔徑為70μm的濾器中，使體細(xì)胞（如紅細(xì)胞）和組織碎片通過(guò)，但能留下胚胎（直徑約150～200μm）。 然后將濾器中的物質(zhì)再轉(zhuǎn)入有方格標(biāo)記的皮氏培養(yǎng)皿中，同時(shí)用沖胚液反復(fù)洗滌濾器底部。采用漏斗或其他錐狀玻璃器皿用沉淀法收集胚胎，檢胚時(shí)，黏液和其他碎片可能會(huì)把胚胎包裹起來(lái)干擾操作。檢胚在立體顯微鏡50～100倍放大下進(jìn)行，找到胚胎后將其轉(zhuǎn)入小的加有5～10%FCS的DPBS小培養(yǎng)皿中。

2 胚胎質(zhì)量的評(píng)價(jià)

在不含血液和組織碎片的皮氏培養(yǎng)皿中對(duì)胚胎發(fā)育階段和質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估應(yīng)按國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)胚胎所處的發(fā)育階段和胚胎質(zhì)量。在第6～7天回收的受精卵中，大多數(shù)胚胎都處于致密桑葚胚、早期囊胚、囊胚或擴(kuò)張囊胚階段。如果在發(fā)情后第8天前回收胚胎，則很少能見(jiàn)到孵化囊胚。致密桑葚胚至少應(yīng)有16個(gè)細(xì)胞，單個(gè)卵裂球的表面應(yīng)清晰。雖然在早期囊胚期囊胚腔小，但可區(qū)別內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞。當(dāng)在培養(yǎng)皿中觀察時(shí)，胚胎可能會(huì)吸入一些液體，形成一個(gè)或小或大的囊胚腔，這是胚胎健康又質(zhì)量高的標(biāo)志。但體外生產(chǎn)的胚胎卻很少看到這樣的現(xiàn)象。胚胎質(zhì)量一般評(píng)定為優(yōu)質(zhì)、良好、一般、較差4等，另外還需辨別出未受精的卵子（UFOs）。 要清晰地辨別出優(yōu)質(zhì)和良好的胚胎比較困難，因?yàn)樗鼈兌汲是蛐?，卵裂球無(wú)退化應(yīng)現(xiàn)象。質(zhì)量屬于一般范疇的胚胎，有些卵裂球或許發(fā)生退化，位于滋養(yǎng)層細(xì)胞之外，不再參與胚胎形成。質(zhì)量屬于較差范疇的胚胎，正常卵裂球數(shù)極少。未受精卵子可能會(huì)呈現(xiàn)不同的形狀，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象，或者會(huì)包含有降解的分布不均勻的卵質(zhì)。

體內(nèi)產(chǎn)生的牛桑葚胚和囊胚活力很強(qiáng)，可保存在小皮氏培養(yǎng)皿（內(nèi)有適量培養(yǎng)液）中，或是保存在人工授精用細(xì)管中，在室溫下保存24h而活力并不喪失。如果回收后在4℃條件下保存48h，也能得到令人滿意的妊娠率。此外，體內(nèi)生產(chǎn)的胚胎對(duì)冷凍和玻璃化過(guò)程的耐受性也很強(qiáng)。

胚胎回收的結(jié)果有很大差異，因?yàn)樗鼈內(nèi)Q于供體對(duì)超排的反應(yīng)性。雖然如此，一般來(lái)說(shuō)期望能得到如下結(jié)果，5%的供體由于對(duì)超排刺激的反應(yīng)性很低而不能沖胚；20%的供體回收的胚胎不宜移植或沒(méi)育后力；每個(gè)供體胚胎或UFOs的總數(shù)為8～10個(gè)，其中約6個(gè)胚胎可以移植。