兩種復(fù)合誘變方法選育擲孢酵母高產(chǎn)油脂菌株

劉 欣，朱健樹，劉楊洋，黃玉蕓，李子洋，許滋楊，韓玉成(.長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，長春 3002；2.吉林省石化資源與生物質(zhì)綜合利用工程實驗室，長春 3002)

近年來，能源危機和環(huán)境污染已成為全人類面臨的重大課題，其中石油供需矛盾尤為突出，研究新的可替代能源迫在眉睫[1]。生物柴油是新能源的一種，燃燒性能好，含硫量低，可代替化石燃料，且環(huán)?？稍偕鶾2]。目前生產(chǎn)生物柴油的主要原料為動植物油脂等可再生資源，但利用動植物油脂為原料成本高，其成本占到總生產(chǎn)成本的70%～85%，且受場地、季節(jié)、氣候的影響較大，經(jīng)濟(jì)可行性差，制約了生物柴油的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂[3]，是指由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚?，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂[4]。微生物油脂具有發(fā)酵周期短，來源比較廣泛，不受季節(jié)、場地、環(huán)境變化影響等優(yōu)點，是生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟(jì)的重要研究方向。其中酵母菌在油脂發(fā)酵過程中能積累較大的生物量，且原料來源廣泛，受到科研工作者的極大關(guān)注。擲孢酵母(Sporobolomycesreseus)是傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)菌，其質(zhì)量的優(yōu)劣對工業(yè)發(fā)酵至關(guān)重要。誘變是改良菌種的基本方法，但單獨使用一種誘變方法，誘變效率低，且易發(fā)生回復(fù)突變，因而通常采用物理化學(xué)復(fù)合誘變的方法改良菌種。目前，在其他酵母體系中采用的有效復(fù)合誘變方法是紫外(UV)與亞硝基胍(NTG)復(fù)合誘變和紫外(UV)與硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變[5-6]?；诖耍狙芯坎捎靡陨蟽煞N復(fù)合誘變方式對原始菌株擲孢酵母As.2.618進(jìn)行誘變育種，以篩選高產(chǎn)油脂突變株，進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量及低溫流動性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

擲孢酵母(Sporobolomycesreseus)As.2.618，購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

葡萄糖，酵母浸膏粉，瓊脂粉，蛋白胨，MgSO4·7H2O，KH2PO4，(NH4)2SO4，無水乙醇，氯化鈉，正己烷，石油醚，甲醇，二甲基亞砜，DES，NTG，淺藍(lán)菌素(Cerulenin)，馬來酰肼。

淺藍(lán)菌素母液(2.24×10-3mol/L)：5 mg淺藍(lán)菌素充分溶解于10 mL二甲基亞砜中。母液經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾除菌備用。

2% DES溶液：取0.4 mL DES用少量乙醇溶解，再加2 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖液，定容至20 mL。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：14%麥芽汁斜面培養(yǎng)基，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏0.5 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基：葡萄糖103 g/L，酵母膏11.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，KH2PO40.1 g/L，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

普通平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.0～6.5 g/L，121℃滅菌30 min。

淺藍(lán)菌素篩選平板培養(yǎng)基：普通平板培養(yǎng)基(1 L)滅菌后降溫至50℃，分別向其中加入20、40、60、80、100、120、140、160 μL的淺藍(lán)菌素母液制成篩選平板培養(yǎng)基后倒平板。

馬來酰肼篩選平板培養(yǎng)基：向普通平板培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的馬來酰肼至終質(zhì)量濃度分別為1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 g/L。超聲溶解，滅菌后倒平板。

1.1.4 儀器與設(shè)備

超凈工作臺，紫外分光光度計，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，高壓蒸汽鍋，離心機，顯微鏡，電子分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與發(fā)酵培養(yǎng)

菌種活化：將擲孢酵母As.2.618接于斜面培養(yǎng)基上26℃培養(yǎng)96 h。

種子擴大培養(yǎng)：將在斜面培養(yǎng)基上活化后的菌種接1環(huán)到液體種子培養(yǎng)液中，250 mL三角瓶裝液量為50 mL，培養(yǎng)條件為26℃，180 r/min，活化48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)48 h后的種子液以10%的接種量接于發(fā)酵搖瓶進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)脂。向裝液量為250 mL 三角瓶中裝入50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度26℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)120 h。

1.2.2 菌種選育

1.2.2.1 UV-NTG復(fù)合誘變及馬來酰肼篩選

紫外誘變：取對數(shù)生長期的菌體用無菌水配制成108個/mL菌懸液，置于功率15 W的紫外燈20 cm 處，磁力攪拌。紫外照射時間分別為10、20、30、40、50 s，以不同照射時間獲得不同誘變劑量[7]。誘變完畢后，在紅光下分別取0.10 mL的菌液進(jìn)行平板涂布，26℃避光培養(yǎng)48 h后以未誘變菌液為對照，計算并繪制致死率曲線。選取致死率為70%～80%的紫外照射時間為最佳紫外誘變劑量。致死率=(對照組菌落數(shù)-誘變后菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)×100%。

NTG誘變：將經(jīng)紫外誘變選育的突變株進(jìn)行活化，用無菌水稀釋至108個/mL。以不同質(zhì)量濃度NTG獲得不同誘變劑量[8]，向菌懸液中添加NTG至終質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L。振蕩處理30 min后，將其涂布于普通平板培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)48 h，以未經(jīng)誘變處理的菌液平板菌落作對照，計算致死率并繪制NTG致死率曲線。選取致死率為70%～80%的NTG終質(zhì)量濃度作為最佳誘變劑量。

馬來酰肼初篩：經(jīng)UV-NTG復(fù)合誘變后，挑取菌落較大且菌落形態(tài)與原始菌株的菌落形態(tài)有明顯不同的突變株活化，配制成108個/mL的菌懸液，分別取0.10 mL菌液涂布于1.1.3所示的不同終質(zhì)量濃度的馬來酰肼篩選平板中，以未添加抑制劑的平板作對照，26℃恒溫培養(yǎng)48 h，計算存活率[9]并繪制馬來酰肼存活率曲線。存活率=誘變后菌落數(shù)/對照組菌落數(shù)×100%。

1.2.2.2 UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選

紫外誘變：采用1.2.2.1中所述最佳紫外誘變條件對原始菌株進(jìn)行誘變，選育長勢較好的突變株。

DES誘變：將上述突變株活化后稀釋至108個/mL，分別取50 mL菌懸液，加入1.2 mL 2%DES溶液，以不同的DES處理時間獲得不同誘變劑量，振蕩處理40、60、80、100、120 min后[5]，加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。取0.10 mL誘變后菌液均勻涂布于普通平板培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)48 h后，計算并繪制DES致死率曲線。選取致死率為70%～80%的DES振蕩時間作為最佳誘變劑量。

淺藍(lán)菌素初篩：將UV-DES復(fù)合誘變選育出的突變株于淺藍(lán)菌素篩選平板上篩選，方法同1.2.2.1中馬來酰肼初篩。

1.2.2.3 突變株復(fù)篩及遺傳穩(wěn)定性實驗

復(fù)篩：分別從兩種初篩平板中各挑選5株長勢較好的突變株，移至搖瓶進(jìn)行發(fā)酵，通過生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量3個指標(biāo)判斷菌株的誘變效果。

傳代：將上述油脂產(chǎn)量最高的突變株連續(xù)5次傳代培養(yǎng)后測定其生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量，并比較前后數(shù)值的變化。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物量的測定

發(fā)酵液于7 000 r/min下離心5 min后，傾去上清液，沉淀(菌體)用蒸餾水離心清洗2次，轉(zhuǎn)入已經(jīng)稱量好的稱量皿中，于90～100℃烘至恒重(含水量在4%以下)。生物量=干菌體質(zhì)量/發(fā)酵液體積。

1.2.3.2 油脂的提取測定

采用酸熱法提取油脂[10]。

油脂產(chǎn)量=油脂質(zhì)量/發(fā)酵液體積

油脂含量=油脂產(chǎn)量/生物量×100%

1.2.3.3 油脂脂肪酸分析

參照文獻(xiàn)[11]對油脂進(jìn)行甲酯化，采用氣相色譜進(jìn)行脂肪酸組分分析。氣相色譜條件：GC6890N氣相色譜儀，DB-23色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器，溫度250℃；載氣為氮氣，流速40 mL/min，氫氣流速40 mL/min，空氣流速350 mL/min；進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比30∶1；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量1.0 μL；程序升溫為初溫120℃，保持2 min，以4℃/min升溫至200℃，保持22 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-NTG復(fù)合誘變及馬來酰肼篩選

2.1.1 紫外誘變劑量的確定

按1.2.2.1采用不同的紫外照射時間對原始菌株進(jìn)行處理，以未經(jīng)照射的菌株作為對照，通過平板活菌計數(shù)法計數(shù)照射后的活細(xì)胞含量，計算致死率。以紫外照射時間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)繪制致死率曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 紫外照射時間對致死率的影響

由圖1可知，紫外照射時間對菌株致死率影響較大。在開始的20 s內(nèi)，隨著紫外照射時間的延長，致死率顯著提升，此時致死率為69.48%；但 40 s 后致死率變化減緩，照射40 s和50 s時，致死率分別為84.08%和86.47%。較高的誘變指標(biāo)(致死率)有利于篩選優(yōu)良菌株，但如果紫外照射時間過長，則不利于篩選。因此，選擇70%～80%為目的致死率作為誘變劑量[12]。選擇紫外照射30 s為原始菌株的紫外誘變劑量，此條件下致死率為76.48%。

2.1.2 NTG誘變劑量的確定

NTG是有效的化學(xué)誘變劑，可以使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化，導(dǎo)致DNA復(fù)制時堿基配對錯誤而引起突變[13]。菌株菌懸液經(jīng)不同終質(zhì)量濃度的NTG誘變后致死率見圖2。

圖2 NTG終質(zhì)量濃度對致死率的影響

由圖2可知，隨著NTG終質(zhì)量濃度的增加，致死率逐漸升高。選取致死率70%～80%作為最佳誘變劑量，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度為0.08 g/L時，致死率為78.43%，在目標(biāo)致死范圍之內(nèi)。繼續(xù)提高NTG終質(zhì)量濃度，菌體致死率迅速提高，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 g/L時，致死率為92.16%，菌體接近死亡。因此，選取0.08 g/L為NTG最佳誘變劑量。

2.1.3 馬來酰肼篩選

生物柴油中的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸是經(jīng)一系列脂肪酸脫氫酶脫飽和而產(chǎn)生的，其活性受到馬來酰肼的抑制，使其不能合成正常生理活動所必需的脂肪酸，從而抑制菌株的生長[14]。經(jīng)馬來酰肼篩選后菌落存活率曲線見圖3。

圖3 馬來酰肼處理下擲孢酵母的菌落存活率

由圖3可知，隨著馬來酰肼終質(zhì)量濃度的提高，原始菌株存活率逐漸下降。當(dāng)馬來酰肼終質(zhì)量濃度達(dá)到2.2 g/L時，菌落存活率僅為12.50%，因此選擇2.2 g/L的馬來酰肼作為篩選劑加入平板培養(yǎng)中，初步淘汰脂肪酸脫氫酶酶活較低、不足以維持菌株正常生長的突變株。

2.1.4 突變株復(fù)篩結(jié)果

從馬來酰肼初篩平板中挑選5株長勢較好的菌落進(jìn)行復(fù)篩測定生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量，5株菌株分別命名為UV-NTG-1，UV-NTG-2，UV-NTG-3，UV-NTG-4，UV-NTG-5，結(jié)果見表1。

由表1可知，UV-NTG-2號菌株的生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量最大，分別為39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，較原始菌株分別提高了42.42%、52.30%、116.81%，因此選取該菌株作為UV-NTG復(fù)合誘變的最佳菌株，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，確定其遺傳穩(wěn)定性。

表1 UV-NTG復(fù)合誘變突變株發(fā)酵結(jié)果

2.2 UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選

2.2.1 DES振蕩時間的確定

DES能使DNA烷基化，從而引起DNA復(fù)制時的轉(zhuǎn)換或顛倒而使物種突變或死亡。不同生物對DES的敏感程度不同，因此復(fù)合誘變前需確定菌株的最佳誘變條件[15]。DES振蕩時間對菌體致死率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 DES振蕩時間對致死率的影響

由圖4可知，延長DES的振蕩時間會增加菌體DNA突變的概率，從而提高致死率。當(dāng)DES振蕩時間為100 min時，致死率為70.14%，在目標(biāo)致死范圍內(nèi)。誘變時間為120 min時，致死率高達(dá)93.73%，菌體接近死亡。因此，DES振蕩時間選擇100 min。

2.2.2 淺藍(lán)菌素篩選

β-酮酯酰-ACP合酶是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，可被天然產(chǎn)物淺藍(lán)菌素進(jìn)行不可逆抑制，與其活化位點的半胱氨酸上的巰基發(fā)生共價結(jié)合，形成內(nèi)酰胺環(huán)而使之失活，從而抑制細(xì)胞的生長代謝[16-17]。因此，在含有一定濃度的淺藍(lán)菌素培養(yǎng)基上，只有脂肪酸合成酶活性較高的菌株才能存活下來而被選出。經(jīng)1.2.2.2實驗結(jié)果確定，在淺藍(lán)菌素的作用下，僅有部分平板有少量菌落存活下來，且大小不一。經(jīng)淺藍(lán)菌素篩選菌落存活率曲線見圖5。

由圖5可知，菌落的形成隨淺藍(lán)菌素添加量的增加而逐步減少，當(dāng)淺藍(lán)菌素的添加量達(dá)到160 μL(17.92 μmol/L)時，擲孢酵母的菌落存活率為 9.80%，故以此添加量作為篩選處理的最佳劑量。

圖5 淺藍(lán)菌素處理下擲孢酵母的菌落存活率

2.2.3 UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選

從2.2.2淺藍(lán)菌素篩選平板中挑選其中5株長勢較好的菌落進(jìn)行復(fù)篩，測定編號為UV-DES-1，UV-DES-2，UV-DES-3，UV-DES-4，UV-DES-5突變株的生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

表2 UV-DES復(fù)合誘變突變株發(fā)酵結(jié)果

由表2可知，UV-DES-2號菌株的生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量最大，分別為38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，較原始菌株分別提高了42.24%、59.75%、126.89%。因此，選擇UV-DES-2號菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)，考察突變株的遺傳穩(wěn)定性。從結(jié)果上看，兩種復(fù)合誘變方法都能使菌株的產(chǎn)油能力顯著提高，可以使油脂產(chǎn)量提高1倍以上，但UV-DES復(fù)合誘變方法略優(yōu)于UV-NTG復(fù)合誘變方法。

2.3 油脂脂肪酸分析(見表3)

表3 油脂脂肪酸組成 %

由表3可知，突變株UV-DES-2與UV-NTG-2的脂肪酸組成中，C18∶1的相對含量最高，分別為80.54%和75.35%，分別較原始菌株提高了11.88 個百分點和6.69個百分點；雖然C18∶2含量分別較原始菌株降低了6.45個百分點和2.04個百分點，但十八碳不飽和脂肪酸的總量均較原始菌株有所提高(提高了5.43個百分點和4.65個百分點)；而C20∶1的相對含量均較原始菌株有所下降。在制備生物柴油時，油脂脂肪酸組成中飽和脂肪酸甲酯含量越高且長鏈脂肪酸甲酯含量越多，該生物柴油的低溫流動性越差，因此突變株油脂的流動性較原始菌株高。

2.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性(見表4)

表4 傳代后菌株的發(fā)酵結(jié)果

由表4可知，突變株UV-DES-2與UV-NTG-2連續(xù)傳至第5代的生物量與產(chǎn)油能力分別較第1代無顯著差異，說明兩種誘變菌株具有遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

采用UV-NTG和UV-DES兩種誘變方法對擲孢酵母As.2.618進(jìn)行誘變，得出在UV-NTG復(fù)合誘變及馬來酰肼篩選方法中，紫外最佳誘變劑量為30 s，NTG誘變劑量為0.08 g/L，馬來酰肼終質(zhì)量濃度為2.2 g/L，此條件下獲得突變株UV-NTG-2的生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量分別為39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，較原始菌株分別提高了42.42%、52.30%、116.81%；在UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選中，紫外最佳誘變劑量為30 s，DES振蕩時間為100 min，淺藍(lán)菌素濃度為17.92 μmol/L，在此條件下獲得的突變株UV-DES-2的生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量分別為38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，較原始菌株分別提高了42.24%、59.75%、126.89%。連續(xù)傳代后油脂產(chǎn)量穩(wěn)定，油脂的低溫流動性較原始菌株有所提高，具有遺傳穩(wěn)定性。菌株UV-DES-2產(chǎn)油能力較強，生長性能良好，是一株具有開發(fā)前景的優(yōu)良高產(chǎn)油脂菌株，以此菌株為基礎(chǔ)進(jìn)一步提高油脂含量將是后續(xù)研究中需解決的關(guān)鍵問題。

[1] 王常文, 崔方方, 宋宇.生物柴油的研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].中國油脂, 2014, 39(5):44-47.

[2] WU S G, HU C M, JIN G J, et al.Phosphate-limitation mediated lipid production byRhodosporidiumtoruloides[J].Bioresour Technol, 2010, 101(15):6124-6129.

[3] ZHU L Y, ZONG M H, WU H.Efficient lipid production withTrichosporonfermentans and its use for biodiesel preparation[J].Bioresour Technol, 2008, 99(16):7881-7885.

[4] MITTELBACH M.Fuels from oils and fats: recent developments and perspectives[J].Eur J Lipid Sci Technol, 2015, 117(11):1832-1846.

[5] 李新社, 易自力, 陸步詩, 等.復(fù)合誘變皮狀絲孢酵母選育高產(chǎn)油脂菌株[J].中國油脂, 2010, 35(7):31-34.

[6] 趙豐麗, 黃翠, 陳睿.復(fù)合誘變對酵母產(chǎn)脂的影響及檢測方法的研究[J].中國油脂, 2007, 32(7):34-37.

[7] 李鴻梅, 苗琇巖, 魏明, 等.紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變選育高產(chǎn)多糖羅耳阿太菌[J].食品工業(yè)科技, 2014, 35(20):244-247.

[8] 張祝蘭, 唐文力, 楊煌建, 等.UV與NTG復(fù)合誘變選育咪唑立賓高產(chǎn)菌[J].微生物學(xué)通報, 2010, 37(6):857-860.

[9] 劉勝男, 王亞洲, 石林霞, 等.γ-亞麻酸產(chǎn)生菌的低能離子束誘變選育[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 36(3):76-80.

[10] 孔凡敏, 趙祥穎, 田延軍, 等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J].中國釀造, 2010(5):143-146.

[11] LIU X, ZHANG H M, JI X J, et al.An improved sampling protocol for analysis of intracellular metabolites inMortierellaalpina[J].Biotechnol Lett, 2012, 34:2275-2282.

[12] 李鴻梅, 苗琇巖, 魏明, 等.紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變選育高產(chǎn)多糖羅耳阿太菌[J].食品工業(yè)科技, 2014, 35(20):244-247, 262.

[13] 苗蘭蘭, 張東杰, 王穎.復(fù)合誘變高產(chǎn)金屬硫蛋白酵母菌株的篩選[J].食品科學(xué), 2013, 34(19):261-264.

[14] 戴群, 戴傳超, 顧敏.花生四烯酸高產(chǎn)菌株的誘變和篩選研究[J].食品科技, 2010, 35(1):19-22.

[15] 羅躍中, 蘭立新, 吳永堯.紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變選育高效油脂降解菌株[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(2):295-297.

[16] PTICE A C, CHOI K H, HEATH R J, et al.Inhibition ofbeta-ketoacyl-acyl carrier protein synthases by thiolactomycin and cerulenin[J].J Biol Chem, 2001, 276(9):6551-6559.

[17] 李仁民, 王菊芳, 馬爽, 等.利用脂肪酸合成酶抑制劑和磷酸香草醛反應(yīng)篩選高產(chǎn)油脂酵母菌[J].微生物學(xué)通報, 2008, 35(4):545-549.