曬黃煙調(diào)制期煙葉真菌多樣性研究

米其利，錢穎穎，朱洲海，管 瑩，高 茜，陳建華，謝麗華，李雪梅，霍世東，方 耀，夭建華*，文孟良

（1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明 650106；2.云南大學(xué)，云南省微生物研究所，昆明 650091；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，昆明 650201）

成熟的煙葉采收后，大量的微生物，包括細(xì)菌、真菌、酵母和放線菌等，仍然存在于煙葉的表面或組織內(nèi)。在煙葉的調(diào)制過(guò)程中，這些微生物通過(guò)分解煙葉中的糖類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)來(lái)獲取自身生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)和能量，并將這些大分子物質(zhì)分解為酚類、醇類、酯類等小分子物質(zhì)，微生物的代謝活動(dòng)對(duì)煙葉化學(xué)成分的組成和煙葉品質(zhì)的形成都會(huì)產(chǎn)生重要的影響[1]。煙葉細(xì)菌的多樣性及其對(duì)煙葉品質(zhì)形成的影響研究報(bào)道較多[2-7]。真菌是煙葉微生物的另一大類群，數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌[6]。與細(xì)菌相比，目前對(duì)煙草真菌種群和結(jié)構(gòu)的研究比較少，主要是采用純培養(yǎng)方法對(duì)一些烤煙煙草內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離鑒定[8-11]。煙草真菌具有有利和有害兩個(gè)方面的作用，如防治煙草病蟲(chóng)害[8]、降低煙堿含量[12-14]、改善煙葉品質(zhì)[15-17]、引起煙草病害[18]和煙葉腐爛變質(zhì)等[19-21]。

曬黃煙是我國(guó)特有的一種煙葉類型，幾百年的栽培和種植使之形成了獨(dú)特的煙葉品質(zhì)，是我國(guó)發(fā)展具有獨(dú)特香氣風(fēng)格和口味特征的中式卷煙的優(yōu)質(zhì)原料。本文采用純培養(yǎng)分離和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法，研究曬黃煙煙葉晾曬調(diào)制期真菌群落結(jié)構(gòu)的組成和動(dòng)態(tài)變化，為人工調(diào)控并改進(jìn)曬黃煙煙葉調(diào)制方式，提升煙葉品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品取自曬黃煙云曬1號(hào)調(diào)制過(guò)程中的煙葉，該品種種植于云南盈江弄璋曬黃煙基地。

1.2 方法

1.2.1 煙葉調(diào)制和取樣 云曬1號(hào)煙葉的調(diào)制和取樣方法參照倪紅梅等[7]的方法，2013年3月至4月期間，依次收集下、中和上3個(gè)部位的新鮮煙葉（調(diào)制第1天）、調(diào)制中期煙葉（調(diào)制第7天）和調(diào)制結(jié)束煙葉（調(diào)制第13天）。

1.2.2 真菌的分離和純化 煙葉菌懸液的制備參照雷麗萍等[22]方法，略有改進(jìn)。分別稱取5 g煙葉，剪碎后放入含95 mL無(wú)菌磷酸緩沖液（pH 7.0～7.2）的無(wú)菌料理杯內(nèi)，攪碎處理1 min。倒入無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，置于搖床室溫140 r/m振蕩30 min，再置于超聲波清洗機(jī)中超聲5 min。收集濾液，梯度稀釋后采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）于28℃培養(yǎng)分離真菌。通過(guò)菌落的培養(yǎng)特征，包括菌落形狀、菌落顏色、菌落表面狀態(tài)、隆起狀態(tài)、邊緣情況和孢子顏色等，以及菌絲、孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征進(jìn)行初步歸類，將菌株歸類到各自的形態(tài)型，進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.2.3 菌株DNA提取及ITS序列分析 從每個(gè)形態(tài)型真菌中選1株作為代表，采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取菌株的總DNA。選取真菌ITS基因擴(kuò)增和測(cè)序，引物序列：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， ITS4 ：5'-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3'[23]。將獲得的ITS序列進(jìn)行校正后，使用NCBI GenBank（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性搜索。利用ClustalX軟件對(duì)獲得的ITS序列與近緣種的ITS序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后通過(guò)MEGA 6.0軟件，以Kimura2-parameter模型計(jì)算進(jìn)化距離，基于Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[24]。

1.2.4 物種多樣性分析 調(diào)制期曬黃煙煙葉中純培養(yǎng)真菌的多樣性評(píng)估，采用Shannon多樣性指數(shù)（H’），Simpson多樣性指數(shù)（D）和Shannon均勻度指數(shù)（EH），計(jì)算公式如下：

其中，Ni為樣品中第i個(gè)分類單元的菌株數(shù)目，N為所有菌株數(shù)總和。

2 結(jié)果

2.1 真菌菌株分離結(jié)果

采用PDA培養(yǎng)基和SDA培養(yǎng)基雙平板法，從云曬1號(hào)調(diào)制期煙葉中分離真菌，兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)都比較多，菌落多樣性比較豐富，兩種培養(yǎng)基對(duì)煙葉真菌的分離效果沒(méi)有明顯差異。根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單菌落，共分離獲得126株真菌，其中，57株分離自PDA培養(yǎng)基，69株分離自SDA培養(yǎng)基。自下部煙葉分離得到50株，中部煙葉得到35株，上部煙葉得到41株；調(diào)制中期分離到32株，少于調(diào)制前期的51株和調(diào)制結(jié)束的43株（表1）。

表1 各調(diào)制期煙葉樣本真菌菌株分離數(shù)量Table 1 The fungal isolate amount of curing leaves

2.2 真菌多樣性分析

根據(jù)菌株在PDA和SDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征將獲得的126株真菌初步歸類，選擇代表性菌株進(jìn)行ITS基因序列測(cè)序。將測(cè)定的73株真菌序列分別在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast同源性搜索，獲得近緣種的序列，同源性搜索結(jié)果顯示有38株不同的代表性菌株（表2）。從表2看出，Shannon多樣性指數(shù)（H'）、Simpson多樣性指數(shù)（D）和Shannon均勻度指數(shù)（EH）分別為3.42、0.96和0.71，表明云曬1號(hào)調(diào)制期煙葉樣本中純培養(yǎng)真菌的類群多樣性比較豐富。

38株代表性真菌菌株中，有35株分別與相關(guān)已知真菌菌株的ITS基因序列相似性為100%，另有3株相似性為99%。有11株菌株（YT200045、YT200034、YT200023、YT200123、YT200049、YT200021、YT200092、YT200053、YT200084、YT200003、YT200121）和屬級(jí)分類水平上未知物種的ITS基因序列相似性是100%，有3株菌株YT200010、YT200101和YT200124與屬級(jí)分類水平上未知物種的ITS基因序列相似性為99%（表2），推測(cè)該14株菌可能是分類地位未確定的物種。

表2 曬黃煙調(diào)制期煙葉樣本中純培養(yǎng)真菌的分離和近緣種分析Table 2 The fungal isolation and analysis of yellow sun-cured tobacco curing leaves with closest species

由表3看出，在126株真菌中，絕大多數(shù)菌株（118株）屬于子囊菌門（Ascomycota），占總數(shù)的93.65%。子囊菌門的菌株在綱、目、科和屬等分類水平上的多樣性較為豐富，包括4綱、9目、13科、16屬。僅有8株菌株屬于接合菌門（Zygomycota），占6.35%，僅1個(gè)屬。在綱分類水平上，座囊菌綱（Dothideomycetes），有53株，占42.06%；糞殼菌綱（Sordariomycetes），有51株，占40.48%；散囊菌綱（Eurotiomycetes），有12株，占9.52%；盤菌綱（Pezizomycetes），有2株，占1.59%；接合菌綱（Zygomycetes），有8株，占6.35%。在目分類水平上，格孢腔菌目（Pleosporales）為優(yōu)勢(shì)目，有51株，占40.48%；其次是肉座菌目（Hypocreales）、炭角菌目（Xylariales）和散囊菌目（Eurotiales），分別有22、17和12株；屬于假毛球殼目（Trichosphaeriales）、盤菌目（Pezizales）、糞殼菌目（Sordariales）、小叢殼目（Glomerellales）和縱裂菌目（Hysteriales）等目的菌株相對(duì)較少。在科分類水平上，亞隔孢殼科（Didymellaceae），有39株，占30.95%；梨孢假殼科（Apiosporaceae），有17株，占13.49%；叢赤殼科（Nectriaceae），有15株，占11.90%；曲霉科（Aspergillaceae）和格孢腔菌科（Pleosporaceae），各有10株，分別占7.94%；假毛殼球科（Trichosphaeriaceae），有9株，占7.14%；肉座菌科（Hypocreaceae），有7株，占5.56%；發(fā)菌科（Trichocomaceae）、火絲菌科（Pyronemataceae）、小不整球殼科（Plectosphaerellaceae）、縱裂菌科（Hysteriaceae）和莢孢腔菌科（Sporormiaceae）各有2株，分別占1.59%；毛殼菌科（Chaetomiaceae），有1株，占0.79%。

在屬的分類水平上，126株真菌的分布如圖1，附球菌屬（Epicoccum）、節(jié)菱孢屬（Arthrinium）和鐮孢菌屬（Fusarium）分離菌株數(shù)量相對(duì)較多，是曬黃煙煙葉真菌的優(yōu)勢(shì)類群，分別有29株、17株、15株，占分離菌株總數(shù)分別為23.02%、13.49%和11.90%；其次是鏈格孢屬（Alternaria）和黑孢菌屬（Nigrospora），分別有10株和9株；毛霉屬（Mucor）和莖點(diǎn)霉屬（Phoma），各有 8株；木霉屬（Trichoderma）和青霉屬（Penicillium），各有7株；曲霉屬（Aspergillus），有 3株；踝節(jié)菌屬（Talaromyces）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）、無(wú)墊船殼菌屬（Psiloglonium）、亞隔孢殼屬（Didymella）、分孢梗殼菌屬（Pycnidiophora）和火絲菌屬（Pyronema），各有2株；毛殼屬（Chaetomium），有1株。

表3 曬黃煙煙葉中純培養(yǎng)真菌的菌群結(jié)構(gòu)Table 3 Composition of cultured fungi isolated from yellow sun-cured tobacco leaves

圖1 126株真菌分離菌株在屬級(jí)分類水平的分布Fig.1 The distribution of 126 fungal strains from yellow sun-cured curing tobacco leaves in genus

利用ClustalX 1.8軟件進(jìn)行菌株ITS序列的多重比對(duì)后，用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1000次Bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，曬黃煙調(diào)制期煙葉純培養(yǎng)真菌聚類為2個(gè)大分支：A分支和B分支。A分支為子囊菌門，包括Ⅰ亞分支、Ⅱ亞分支、Ⅲ亞分支和Ⅳ亞分支，依次為糞殼菌綱、散囊菌綱、盤菌綱和座囊菌綱。B分支為接合菌門，由Ⅴ亞分支接合菌綱組成。

3 討論

本文選用PDA和SDA兩種培養(yǎng)基對(duì)調(diào)制期云南曬黃煙煙葉的純培養(yǎng)真菌進(jìn)行了分離，共獲得126株菌株。根據(jù)菌株的形態(tài)特征和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，126株真菌分布在2門、5綱、10目、14科和17屬，這17個(gè)屬分別為附球菌屬、節(jié)菱孢屬、鐮孢菌屬、鏈格孢屬、黑孢菌屬、毛霉屬、木霉屬、青霉屬、莖點(diǎn)霉屬、曲霉屬、踝節(jié)菌屬、小不整球殼屬、無(wú)墊船殼菌屬、亞隔孢殼屬、分孢梗殼菌屬、火絲菌屬和毛殼屬，有14株菌可能是未確定分類地位的物種。

曬黃煙在調(diào)制期煙葉的優(yōu)勢(shì)真菌類群為附球菌屬、節(jié)菱孢屬和鐮孢菌屬，分別占分離菌株總數(shù)的23.02%、13.49%和11.90%。附球菌屬菌株在衰老或剛死亡的植株表面能迅速產(chǎn)生分生孢子和抗真菌化合物[25]，因此可以作為一種生防菌應(yīng)用于植物病害的生物防治中，例如可以降低核盤菌對(duì)萵苣的侵染[26]，抑制小麥禾旋孢腔菌的生長(zhǎng)[27]，抑制桃樹(shù)的桃褐腐病的發(fā)生[28]，拮抗樟子松枯梢病病原菌的生長(zhǎng)[29]等。而鐮孢菌屬菌株可引起多種煙草病害，如煙草枯萎病和鐮刀菌根腐病[30]。對(duì)烤煙的內(nèi)生真菌的研究表明，鏈格孢屬和鐮孢菌屬是主要的真菌類群[8-11]。鏈格孢屬是分布廣泛的重要的半知菌類真菌，能夠引起多種植物病害及腐霉病，造成全球性的巨大經(jīng)濟(jì)損失[31]。

在煙草中，鏈格孢屬菌株也是引起煙草病害的一類重要的致病微生物[32]。本文從曬黃煙煙葉中共分離到10株鏈格孢屬菌株，占分離菌株總數(shù)的7.94%。另一方面，在煙葉的加工和存儲(chǔ)過(guò)程中，某些霉菌的生長(zhǎng)和繁殖，會(huì)造成煙葉的大量霉變，而曲霉、青霉和毛霉屬真菌是引起我國(guó)煙葉霉變的主要菌類[33]。從曬黃煙調(diào)制期煙葉中共分離到3株曲霉、7株青霉和8株毛霉屬菌株，在調(diào)制后的煙葉醇化或存儲(chǔ)中，如遇煙葉受潮以及適宜的環(huán)境溫度和濕度，這些霉菌有可能引起煙葉的霉變。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建純培養(yǎng)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（鄰接法）Fig.2 Phylogenetic tree of cultured fungi of yellow sun-cured tobacco curing leaves basing on ITS sequences(neighbor-joining method)

多種真菌制劑已經(jīng)應(yīng)用到煙草植株病害防治和煙葉的加工過(guò)程。例如任加慶等[34]用8種真菌菌劑處理田間煙草植株葉片發(fā)現(xiàn)，其中一種曲霉菌劑ESF-6在煙草病毒病發(fā)病高峰期的防效為83.8%。高文霞等[17]從煙葉中分離到一株木霉屬菌株YZ2和曲霉屬菌株SZ14，兩株真菌的菌液處理煙絲后，煙葉香氣前體物質(zhì)含量增加，感官評(píng)吸得分顯著提高。周瑾等[15]從煙葉上分離到一株假絲酵母屬（Candida）菌株Yu-1，將真菌懸液應(yīng)用到低次烤煙碎片上，經(jīng)發(fā)酵后，能顯著降低烤煙碎片的刺激性，改善吸味。煙葉真菌在整個(gè)曬黃煙的調(diào)制過(guò)程中都有分布，多樣性指數(shù)分析顯示，曬黃煙調(diào)制期的純培養(yǎng)真菌的多樣性比較豐富，在這些真菌類群中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，從這些真菌中可以篩選出有益的真菌類群，用以防治煙草病蟲(chóng)害、提高煙草產(chǎn)量以及改善煙葉品質(zhì)等。

4 結(jié)論

本研究采用PDA和SDA培養(yǎng)基從調(diào)制期曬黃煙煙葉中共分離獲得126株真菌，下部和上部煙葉分離的菌株數(shù)多于中部煙葉，調(diào)制中期分離的菌株數(shù)少于調(diào)制前期和調(diào)制后期。這些菌株分布在2門、5綱、10目、14科、17屬，其中14株菌可能是未確定分類地位的物種。多樣性指數(shù)分析顯示，曬黃煙煙葉調(diào)制期的純培養(yǎng)真菌類群多樣性比較豐富。所分離的真菌中，93.65%的菌株屬于子囊菌門。優(yōu)勢(shì)屬為附球菌屬、節(jié)菱孢屬和鐮孢菌屬，分別占23.02%、13.49%和11.90%。

[1]祝明亮.煙草調(diào)制期間微生物研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（8）：1278-1281.

[2]陳澤斌，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，等.煙草內(nèi)生細(xì)菌種群特征分析[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2014，20（3）：102-107.

[3]宮長(zhǎng)榮，程龍，宋朝鵬，等.烤煙烘烤過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2010，31（1）：44-46.

[4]HUANG J,YANG J,DUAN Y,etal.Bacterial diversities on unaged and aging flue-cured tobacco leaves estimated by 16S rRNA sequence analysis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,88(2):553-562.

[5]BRANDSCH R.Microbiologyandbiochemistryof nicotine degradation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,69(5):493-498.

[6]MORIN A,PORTER A,JOLY J,et al.Evolution of tobacco-specific nitrosamines and microbial populations during flue-curing of tobacco under direct and indirect heating[J].Beitr?ge zur Tabakforschung/Contributions to Tobacco Research,2004,21(1):40-46.

[7]倪紅梅，李雪梅，謝麗華，等.曬黃煙調(diào)制期葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2015，21（1）：95-99.

[8]裴洲洋.煙草內(nèi)生真菌種群多樣性及煙草赤星病生防內(nèi)生菌的篩選[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[9]李文君，錢正強(qiáng)，金蕊，等.云南大理煙區(qū)煙葉內(nèi)生真菌多樣性及分布特征[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（5）：783-791.

[10]徐慧，楊根華，張敏，等.云南煙草葉片內(nèi)生及葉際細(xì)菌,真菌多樣性研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2014，29（2）：149-154.

[11]劉宏玉，金慧清，王佳瑩，等.煙草內(nèi)生真菌多樣性和種群結(jié)構(gòu)[J].菌物學(xué)報(bào)，2015，34（6）：1058-1067.

[12]SINDELAR R D,ROSAZZA J P,BARFKNECHT C F.N-demethylation of nicotine and reduction of nicotine-1'-N-oxide by Microsporum gypseum[J].Applied and Environmental Microbiology,1979,38(5):836-839.

[13]UCHIDA S,MAEDA S,KISAKI T.Conversion of nicotine into nornicotine and N-methylmyosmine by fungi[J].Agricultural and Biological Chemistry,1983,47(9):1949-1953.

[14]MENG X J,LU L L,GU G F,et al.A novel pathway for nicotine degradation by Aspergillusoryzae 112822 isolated from tobacco leaves[J]. Research in Microbiology,2010,161(7):626-633.

[15]周瑾，李雪梅，許傳坤，等.利用微生物發(fā)酵改良烤煙碎片品質(zhì)的研究[J].煙草科技，2002（6）：3-5.

[16]高文霞，程祖鋅，王峰吉.烤煙有益真菌菌株的篩選與鑒定[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2011，17（5）：90-95.

[17]高文霞，王峰吉，程祖鋅，等.真菌處理對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響及最佳發(fā)酵條件的研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，33（11）：2066-2069.

[18]蒲小明，沈會(huì)芳，陳永明，等.廣東煙葉主要真菌病害無(wú)公害化學(xué)防治藥劑篩選試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（11）：97-102.

[19]WELTY R E,LUCAS G B,FLETCHER J T,et al.Fungi isolated from tobacco leaves and brown-spot lesions before and after flue-curing[J].Applied Microbiology,1968,16(9):1309-1313.

[20]WELTY R E,LUCAS G B.Fungi isolated from damaged flue-cured tobacco[J].Applied Microbiology,1968,16(6):851-854.

[21]何婉文.倉(cāng)儲(chǔ)煙葉霉變及其生物防治措施探討[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2016，36（6）：255-257.

[22]雷麗萍，BUSH L，COYNE M S，等.煙葉生長(zhǎng)和晾制期間細(xì)菌種群動(dòng)態(tài)變化-煙草微生物細(xì)菌調(diào)控技術(shù)研究之一[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2001，22（3）：4-6.

[23]WHITE T J,BRUNS T,LEE S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[J].PCR protocols:a guide to methods and applications,1990,18(1):315-322.

[24]TAMURA K,STECHER G,PETERSON D,et al.MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular Biology and Evolution,2013,30(12):2725-2729.

[25]李揚(yáng)，王亞南，胡同樂(lè)，等.黑附球菌在植物病害生物防治中的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（6）：2988-2990.

[26][MERCIER J,REELEDER R D.Interactions between Sclerotinia sclerotiorum and other fungi on the phylloplane of lettuce[J].Canadian Journal of Botany,1987,65(8):1633-1637.

[27]CAMPBELL W P.The influence of associated microorganisms on the pathogenicity of Helminthosporium sativum[J].Canadian Journalof Botany,1956,34(6):865-874.

[28]MADRIGAL C,PASCUAL S,MELGAREJO P.Biological control of peach twig blight(Monilinia laxa)with Epicoccum nigrum[J].Plant Pathology,1994,43(3):554-561.

[29]李寶年，徐樹(shù)輝，楊傳波，等.樟子松枯梢病拮抗真菌的篩選[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32（5）：97-99.

[30]陳志敏.福建省煙草根莖病害診斷及防治藥劑篩選[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

[31]崔迪，王繼華，陳捷，等.鏈格孢屬真菌對(duì)農(nóng)作物的危害[J].哈爾濱師范大學(xué)（自然科學(xué)學(xué)報(bào)），2005，21（4）：87-91.

[32]張萬(wàn)良，翟爭(zhēng)光，謝揚(yáng)軍，等.煙草赤星病研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（1）：118-120.

[33]李魁，李廷生，王平諸，等.我國(guó)煙草真菌區(qū)系調(diào)查及霉變成因的研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24（3）：20-24.

[34]任加慶，薛守聰，李錫宏，等.不同真菌菌劑對(duì)煙草病毒病的田間防治效果[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2015，36（4）：96-101.