施氮量對(duì)烤煙糖代謝關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)的影響

魯黎明，曾孝敏，張永輝，李立芹*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2.四川省煙草公司瀘州市公司，四川 瀘州 646000）

煙草碳氮代謝強(qiáng)度和兩者之間的協(xié)調(diào)程度及動(dòng)態(tài)變化模式，對(duì)煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)有重大影響[1-2]。煙草的糖代謝是碳代謝的重要組成部分，貫穿了脂類、蛋白質(zhì)、次生物質(zhì)及核酸等代謝過程[3-4]。煙草糖代謝關(guān)鍵酶的活性，除與品種[5-8]、生態(tài)因素[9-11]以及生育時(shí)期[12]等密切相關(guān)外，還受施氮量的制約。許晨曦等[13]報(bào)道，隨施氮量增加，煙草蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶活性均提高；但成熟期淀粉酶活性反而降低。史宏志等[14]認(rèn)為，煙草生長(zhǎng)前期，淀粉酶活性與施氮量呈正相關(guān)，在煙葉成熟階段，則呈負(fù)相關(guān)；而煙葉各生育時(shí)期轉(zhuǎn)化酶的活性，則隨著施氮水平的增加而增高。劉衛(wèi)群等[15]研究表明，煙草轉(zhuǎn)化酶的活性有隨施氮量增加而升高的趨勢(shì)。岳紅賓[16]及李洪臣等[17]均發(fā)現(xiàn)，隨著氮素水平的提高，淀粉酶及轉(zhuǎn)化酶的活性均有升高趨勢(shì)。肖麗娜等[18]研究認(rèn)為，施用無(wú)機(jī)氮烤煙的淀粉酶活性，要高于無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)混氮肥處理。葛國(guó)鋒等[19]報(bào)道，施氮能夠提高烤煙前期蔗糖磷酸合成酶（SPS）及后期蔗糖合成酶（SS）的活性；同時(shí)，同一施氮水平下，紅花大金元與K326的SPS及SS活性有所不同。在煙草糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量研究方面，王紅麗等[20]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Inv）和SS基因隨著煙葉的成熟表達(dá)量升高，不同氮水平處理間無(wú)顯著差異，而SPS基因表達(dá)量在煙葉成熟前期隨施氮量的降低而降低；淀粉合成酶（AM）基因表達(dá)量既不受煙葉成熟時(shí)期的影響，也不受前期供氮水平的影響。

雖然供氮量影響煙草糖代謝關(guān)鍵酶活性的研究較多，但對(duì)其基因表達(dá)影響的研究較少，同時(shí)，還缺乏施氮水平、關(guān)鍵酶活性、基因表達(dá)及糖類代謝物質(zhì)的關(guān)系分析。因此，本研究分析了施氮量對(duì)煙草糖代謝關(guān)鍵酶活性、基因表達(dá)及糖類物質(zhì)含量的影響，以期為煙草糖代謝的理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

烤煙品種云煙87和K326。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年在瀘州市古藺縣箭竹鄉(xiāng)自強(qiáng)村進(jìn)行，土壤為黏土。試驗(yàn)采用兩因素裂區(qū)設(shè)計(jì)，氮肥施用量為主區(qū)因素，品種為副區(qū)因素，共有6個(gè)處理，設(shè)3次重復(fù)。氮肥因素有3個(gè)水平：每667 m2施純氮6 kg（A1）、7 kg（A2）和 8 kg（A3）；品種因素有兩個(gè)：云煙87（B1）和 K326（B2）。每個(gè)小區(qū)栽煙60株，行距1.1 m，株距0.5 m。試驗(yàn)地磷鉀肥每667 m2的施用量為10.5 kg（P2O5）、14 kg（K2O）。

1.3 試驗(yàn)方法

2015年1 月按常規(guī)漂浮育苗法進(jìn)行育苗，4月27日進(jìn)行移栽。70%的氮肥在移栽時(shí)施入，其余在5月13日作為追肥施入。田間管理采用當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉管理規(guī)程進(jìn)行。于移栽后45、60及80 d分小區(qū)進(jìn)行鮮煙葉樣品采集。

每小區(qū)選擇30株長(zhǎng)勢(shì)基本一致煙株并掛牌，每次采摘3片中部葉（第10葉位）。采后迅速沿主脈分開，一半立即用液氮冷凍，保存于-80℃冰箱，用于測(cè)定酶活和基因表達(dá)量；另一半帶回實(shí)驗(yàn)室，105℃殺青，80℃烘干，粉碎保存，用于測(cè)定煙葉中的總糖、還原糖及淀粉含量。

1.4 碳代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定

蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）、轉(zhuǎn)化酶（Inv）及淀粉酶（AM）的測(cè)定方法參照岳紅賓[16]及樊武廣等[21]的方法進(jìn)行。

1.5 基因表達(dá)量分析

樣品總RNA的提取通過Trizol法進(jìn)行[22]。cDNA第一條鏈的合成，按照Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒的操作說明進(jìn)行。

引物設(shè)計(jì)：參考NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中SPS、SS、Inv的基因cds序列進(jìn)行（表1）。

表1 qRT-PCR所用引物序列Table 1 Primers for qRT-PCR

qPCR擴(kuò)增：以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，加入表1中的相應(yīng)引物及其他反應(yīng)試劑，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×Perime SAYB Max 5 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、cDNA2 μL、ddH2O 2 μL，總體積 10 μL。反應(yīng)條件為：50℃孵育2 min，95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s；60℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 2.0軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2 結(jié)果

2.1 氮素供應(yīng)水平對(duì)糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1 蔗糖磷酸合成酶 從表2可以看出，隨著生育時(shí)期的推進(jìn)，SPS酶的活性逐漸升高。同一生育時(shí)期，SPS活性總體呈現(xiàn)高施氮量處理高于低施氮量處理的趨勢(shì)，且在移栽后45 d和移栽后60 d處理間差異顯著，而在移栽后80 d沒有顯著差異。同一施氮量，不同品種之間SPS酶活性表現(xiàn)不一。除A3處理在栽后60及80 d外，其余處理均表現(xiàn)為K326的SPS高于云煙87。

表2 各處理不同時(shí)期蔗糖磷酸合成酶活性Table 2 Sucrose phosphate synthase activity among different treatments at different stages (μg·g-1mf·h-1)

2.1.2 蔗糖合成酶 蔗糖合成酶的活性在處理間及不同生育時(shí)期的變化趨勢(shì)，與SPS較為類似（表3）。隨著煙株的生長(zhǎng)，各個(gè)處理的SS酶活性均呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。同一個(gè)時(shí)期，不處理的SS酶活性存在顯著差異，一般表現(xiàn)為隨著施氮量的增加，酶活性增大。同一時(shí)期、同一施氮量的2個(gè)品種的酶活性差異不顯著。這種現(xiàn)象說明，不同遺傳背景的煙草，其SS酶活性對(duì)氮素的響應(yīng)并無(wú)顯著差異。

2.1.3 轉(zhuǎn)化酶 隨著生育時(shí)期的推進(jìn)，處理A1B1、A1B2和A2B1的轉(zhuǎn)化酶的活性逐漸上升（表4）；處理A2B2、A3B1和A3B2的酶活性則呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，栽后80 d的酶活性仍明顯高于栽后45 d。同一生育時(shí)期內(nèi)，各處理的轉(zhuǎn)化酶活性在栽后45 d無(wú)顯著差異，在栽后60 d，高施氮量的酶活性要高于低施氮量；而在栽后80 d，則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。對(duì)于同一施氮量、同一時(shí)期來說，除栽后60 dA2處理外，其余處理的品種間轉(zhuǎn)化酶活性均無(wú)差異。

2.1.4 淀粉酶 淀粉酶可將葉綠體中的淀粉水解為單糖，直接影響到煙葉中淀粉的積累。各處理不同時(shí)期淀粉酶的活性見表5。淀粉酶活性隨生育期的變化呈現(xiàn)兩種趨勢(shì)，處理A1B1和A1B2為一直上升，其余處理則為先升高而后降低。同一生育時(shí)期不同施氮量間差異顯著。在栽后45及60 d，隨著施氮量的增加，淀粉酶的活性也隨之增加；而在栽后80 d，則表現(xiàn)為低施氮量的酶活高于中、高施氮量。同一施氮量不同品種間，其淀粉酶的活性沒有顯著差異。

表3 各處理不同時(shí)期蔗糖合成酶活性Table 3 Sucrose synthase activity among different treatments at different stages (μg·g-1mf·h-1)

表4 各處理不同時(shí)期轉(zhuǎn)化酶活性Table 4 Converting enzyme activity among different treatments at different stages (μg·g-1mf·h-1)

表5 各處理不同時(shí)期淀粉酶活性Table 5 Amylase enzyme activity among different treatments at different stages (μg·g-1mf·h-1)

2.2 氮素供應(yīng)水平對(duì)糖代謝關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.2.1 蔗糖磷酸合成酶基因相對(duì)表達(dá)量 蔗糖磷酸合成酶，能夠催化蔗糖的合成以及控制碳素的分配及流向，在植物的碳代謝中起著關(guān)鍵的作用。從整個(gè)大田生育期來看（圖1），蔗糖磷酸合成酶基因的相對(duì)表達(dá)量，總體呈現(xiàn)出先下降后上升的情況，并在栽后60 d達(dá)到最低。同一生育時(shí)期不同處理之間，基因的表達(dá)量存在差異，其中，A1B1栽后45 d、A3B2栽后60 d及A1B2栽后80 d表達(dá)量較高。此外，同一時(shí)期同一施氮量不同品種間，基因表達(dá)量并不一致，但沒有一定的規(guī)律性。

2.2.2 蔗糖合成酶基因相對(duì)表達(dá)量 蔗糖合成酶在移栽后45 d的相對(duì)表達(dá)量最高，然后下降，雖然有所波動(dòng)，但總體上維持一個(gè)較低的表達(dá)水平（圖2）。3個(gè)時(shí)期蔗糖合成酶基因相對(duì)表達(dá)量較高的處理分別是A2B1、A1B2及A2B1。

2.2.3 轉(zhuǎn)化酶基因相對(duì)表達(dá)量 蔗糖轉(zhuǎn)化酶是衡量植物碳代謝強(qiáng)度的一個(gè)標(biāo)志性的酶，在調(diào)控植物衰老及果實(shí)發(fā)育中起重要作用。從移栽后45 d到移栽后80 d，各個(gè)處理的轉(zhuǎn)化酶基因的相對(duì)表達(dá)量基本上是上升的趨勢(shì)，并在栽后60 d達(dá)到高峰，然后有所下降，但仍然高于栽后45 d（圖3）。就同一時(shí)期不同處理的基因表達(dá)量來看，栽后45 d的A3B1、栽后60 d的A3B2以及栽后80 d的A1B1較高。

圖1 各處理不同時(shí)期蔗糖磷酸合成酶基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Comparison of relative expression levels of sucrose phosphate synthase gene among different treatments at different stages

圖2 各處理不同時(shí)期蔗糖合成酶基因相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Comparison of relative expression levels of sucrose synthase gene among different treatments at different stages

圖3 各處理不同時(shí)期轉(zhuǎn)化酶基因相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Comparison of relative expression levels of the invertase gene among different treatments at different stages

2.3 氮素供應(yīng)水平對(duì)鮮煙葉糖類物質(zhì)含量的影響

2.3.1 總糖與還原糖 各處理鮮煙葉總糖含量，表現(xiàn)為隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)而逐漸降低的趨勢(shì)（表6），在栽后80 d達(dá)到最低。同時(shí)，除栽后60 d外，在另外兩個(gè)生育時(shí)期，各處理之間的總糖含量均無(wú)顯著差異。在栽后60 d，A1與A3處理，兩個(gè)品種之間的總糖含量均存在顯著差異，但規(guī)律性不強(qiáng)。

總體來看，各處理鮮煙葉中的還原糖含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（表7）。此外，在栽后45 d，各處理之間鮮煙葉還原糖含量并無(wú)顯著差異。然而，在栽后60及80 d，處理之間就存在顯著差異，但無(wú)明顯的規(guī)律性；同時(shí)，栽后60 d的A1施氮量與栽后80 d的A2施氮量，存在品種間的顯著差異。

表6 各處理不同時(shí)期鮮煙葉總糖含量Table 6 Total sugar content of tobacco leaves among different treatments at different stages %

表7 各處理不同時(shí)期鮮煙葉還原糖含量Table 7 Reduced sugar content of tobacco leaves among different treatments at different stages %

2.3.2 淀粉 在大田生育期內(nèi)，各處理鮮煙葉的淀粉的含量均表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，并在栽后80 d達(dá)到最高（表8）。在各個(gè)生育時(shí)期，處理間的淀粉含量存在顯著差異，主要表現(xiàn)在7和8 kg/667m2施氮量處理顯著高于6 kg/667 m2處理。此外，除A2處理外，同一施氮量?jī)?nèi)，兩個(gè)品種之間的淀粉含量沒有顯著的差異。

表8 各處理不同時(shí)期鮮煙葉淀粉含量Table 8 Total starch content of tobacco leaves among different treatments at different stages %

2.4 糖代謝關(guān)鍵酶活性與糖類物質(zhì)的相關(guān)分析

由表9可見，SS酶活性與鮮煙葉淀粉含量，在栽后45 d及60 d呈極顯著正相關(guān)；SPS酶活性在栽后60 d及80 d，呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)；Inv酶活性在栽后80 d，呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)；AM酶活性在栽后60 d及80 d，分別呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)與負(fù)相關(guān)。

2.5 糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與糖類物質(zhì)的相關(guān)分析

由表10可見，蔗糖合成酶基因與栽后60 d的還原糖含量，及栽后80 d的總糖含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)；而蔗糖磷酸合成酶基因則與栽后45 d的淀粉含量呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。

3 討論

煙葉的蔗糖轉(zhuǎn)化酶和淀粉酶活性，與碳代謝強(qiáng)度密切相關(guān)，是衡量同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和利用、植物細(xì)胞代謝及生長(zhǎng)強(qiáng)度的指標(biāo)[23-25]。本研究進(jìn)行了烤煙全生育期糖代謝關(guān)鍵酶活性及糖含量的分析，結(jié)果顯示，蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶的活性，均隨著煙株的生長(zhǎng)發(fā)育而逐步增加，并且隨著施氮量的增加而增加，同時(shí)伴隨著總糖與還原糖的含量的下降，說明本研究的施氮量下，煙株均能夠適時(shí)地由氮代謝逐漸向碳代謝轉(zhuǎn)變。同時(shí)，在整個(gè)生育期內(nèi)，轉(zhuǎn)化酶及淀粉酶的活性表現(xiàn)為先升高而后下降的趨勢(shì)，煙葉中的淀粉含量急劇上升。這種總糖與還原糖的含量的下降與淀粉含量的上升，同樣說明在煙葉生長(zhǎng)后期，煙株以碳代謝為主，淀粉為葉片中碳水化合物的主要積累形式，從而為煙葉調(diào)制期間淀粉降解為可溶性糖奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。糖代謝關(guān)鍵酶的活性與糖類物質(zhì)的相關(guān)性分析，也說明了關(guān)鍵酶的活性與煙葉中總糖、還原糖及淀粉的含量密切相關(guān)。此外，K326與云煙87為本研究的兩個(gè)參試品種。由于兩者的親緣關(guān)系較近、遺傳背景相似度較高，其糖代謝特征特性也基本類似，因此，導(dǎo)致了在同一生育期同一施氮量處理下，兩者的關(guān)鍵酶活差異不顯著。

表9 糖代謝關(guān)鍵酶活性與糖類物質(zhì)的相關(guān)性Table 9 Correlation of enzyme activity in sugar metabolism with sugar content in tobacco leaves

糖代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，與煙葉中糖類物質(zhì)的含量息息相關(guān)。王紅麗等[20]的研究表明，SPS基因表達(dá)量，盡管在中期有一個(gè)低谷，但就整個(gè)生育期而言基本變化不大；Inv基因表達(dá)量，隨著煙葉的成熟而升高，這與本研究的結(jié)果相一致。同時(shí)，SPS、SS及Inv基因的表達(dá)量與煙葉中總糖、還原糖及淀粉含量的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在烤煙大田生長(zhǎng)期，SPS基因與SS基因分別與煙葉中總糖、還原糖及淀粉含量呈現(xiàn)顯著的相關(guān)關(guān)系。說明，煙葉糖代謝中的基因表達(dá)量、酶活及糖類物質(zhì)含量之間的存在著密切的關(guān)系，通過相關(guān)基因的表達(dá)量，可以在一定程度上預(yù)測(cè)糖類物質(zhì)的含量。

氮素對(duì)煙葉的產(chǎn)量與品質(zhì)影響巨大[26]。而氮素通過影響糖代謝而影響其品質(zhì)與產(chǎn)量，則是一個(gè)非常復(fù)雜的生化過程。深入分析其中的分子機(jī)制，對(duì)于提高煙葉的品質(zhì)，具有十分重要的意義。

4 結(jié)論

供氮水平對(duì)煙草糖代謝關(guān)鍵酶活性及基因的表達(dá)量有著顯著的影響。鮮煙葉中的總糖和還原糖含量，受施氮量的影響較小；但淀粉的含量卻隨著施氮量的增加而顯著增加。糖代謝關(guān)鍵酶的活性，直接影響著煙葉中的淀粉含量；糖代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，與鮮煙葉糖類物質(zhì)的含量關(guān)系密切。因此，施氮量的高低，對(duì)煙葉中糖類物質(zhì)的含量有重要影響。

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