煙葉落黃過程中煙堿代謝規(guī)律及相關(guān)基因表達(dá)分析

張震彪，李 偉，杜詠梅，張海良，劉 成，李曉旭，郭永峰*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

煙堿是重要的氮素化合物，其含量高低直接影響煙葉品質(zhì)及香味，培育適宜煙堿含量的煙草品種，提高煙葉質(zhì)量、降低卷煙制品對健康的危害一直是生產(chǎn)上追求的目標(biāo)[1]；了解煙葉落黃過程中煙堿代謝規(guī)律及基因表達(dá)變化，對改良煙草品質(zhì)、指導(dǎo)煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義[2]。

煙堿是生物堿中最主要成分，其干重占90%以上[3]，煙堿合成部位為植物根部，利用維管組織運輸至葉片中，儲存于植物葉片的液泡[4]。目前煙堿合成機制已基本闡明，包括吡咯環(huán)和吡啶環(huán)的形成、兩環(huán)的縮合。吡咯環(huán)和吡啶環(huán)合成較復(fù)雜，需經(jīng)歷多個酶促反應(yīng)，如精氨酸脫羧酶（argininedecarboxylase,ADC)催化精氨酸形成腐胺[5]，腐胺在腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（putrescineN-methyltransferase,PMT）作用下形成N-甲基腐胺（N-methyltransferase）[6]，N-甲基腐胺氧化酶（N-methyltransferase oxidase，MPO）氧化N-甲基腐胺形成4-甲氨基丁醚[7]等，而吡啶環(huán)生成需要喹啉酸合成酶（quinolinate synthase,QS）、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase,QPT)的參與[5,8]，最終兩環(huán)在黃酮還原酶A622和小檗堿橋連酶BBL的作用下縮合形成煙堿[9-10]，目前兩環(huán)縮合的機制仍未知，參與縮合的煙堿合成酶基因尚未被克隆。

煙葉成熟衰老過程中，煙堿發(fā)生去甲基化而轉(zhuǎn)化成降煙堿，其中CYP82E4v1是該過程的重要調(diào)控因子[11]，進(jìn)一步研究證實CYP82E5v2、CYP82E2和CYP82E10也參與此反應(yīng)[12]，不同的是CYP82E4v1在衰老組織中表達(dá)活躍，而CYP82E5v2主要在未衰老的組織中表達(dá)。衰老后期煙葉中的煙堿含量升高，其中JAT1、MATE和NUP1蛋白發(fā)揮重要轉(zhuǎn)運功能，JAT1、MATE主要位于液泡膜上，負(fù)責(zé)將胞質(zhì)內(nèi)煙堿轉(zhuǎn)運至液泡內(nèi)，而NUP1定位于質(zhì)膜，主要運輸胞質(zhì)外煙堿至胞內(nèi)，此外NUP1具有很強的特異性，不能轉(zhuǎn)運新煙堿和降煙堿[13]。煙堿合成過程受植物激素調(diào)控，如茉莉酸、生長素、乙烯等[6]，茉莉酸能夠激活煙堿合成基因的表達(dá)，而生長素和乙烯是煙堿合成的負(fù)調(diào)控因子，抑制煙堿的合成；同時，COI1和JAZ1以及肌醇戊基磷酸分子組成的茉莉酸受體復(fù)合體能夠感知并應(yīng)答茉莉酸信號，改變煙堿合成基因的轉(zhuǎn)錄活性，影響煙堿合成[14]；此外，轉(zhuǎn)錄因子ERF32、ORC1、bHLH1/2和MYC2等通過介導(dǎo)JA途徑也參與調(diào)控?zé)焿A代謝[15-17]。

煙草作為生物學(xué)研究的模式植物，其煙堿合成、遺傳調(diào)控及轉(zhuǎn)運機制已基本闡明，代謝途徑相關(guān)基因、重要調(diào)控因子和轉(zhuǎn)運蛋白均已被克隆和鑒定，而煙葉落黃衰老過程中煙堿代謝變化及相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律尚未明確；本試驗以普通煙草紅花大金元為材料，選取打頂后15、25、35、45、55、65、75、85 d中部葉片，分析打頂后不同衰老時期煙葉生物堿的含量變化；利用該樣品已測定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析煙堿代謝相關(guān)基因表達(dá)模式；對15、45、55、75 d的樣品進(jìn)行煙堿代謝相關(guān)基因定量分析，驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；為進(jìn)一步解析煙草煙堿代謝調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試材料：普通煙草（Nicotiana tabacum）紅花大金元，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所種質(zhì)資源中心提供。

試驗試劑：RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Fast qPCR Mix均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 2013年3月溫室播種，4片真葉時假植，8片真葉移栽至大田，以中部葉（自下而上第9～10片）為研究對象，煙株打頂后15 d第1次取樣，以后每隔10天取樣1次，共計8次，分別代表不同衰老程度的煙草葉片。取樣時選擇生長狀態(tài)一致的植株，在相同葉位每株僅取1次，選取12個單株為一次樣品采集，每3株混合為一個樣本，4次生物學(xué)重復(fù)。收取的每個葉片以主葉脈為界一分為二，分別用于生物堿含量測定和RNA提取，液氮速凍后-80℃保存。

1.2.2 生物堿含量測定 將煙草葉片液氮研磨至細(xì)粉末狀，冷凍干燥48 h，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定樣品中生物堿的含量，主要包括煙堿、去甲基煙堿、新煙草堿、麥斯明，以國標(biāo)為參照進(jìn)行。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組分析煙堿代謝相關(guān)基因 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索煙堿代謝相關(guān)基因序列，分別比對中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫（未公開發(fā)表），提取基因ID；根據(jù)本實驗室已有的煙草葉片衰老轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從差異表達(dá)基因（|log2|≥1，p≤0.05）中篩選ID號，結(jié)果見表1，提取煙堿代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用熱圖繪制軟件GSP，Heml繪制基因表達(dá)熱圖，將表達(dá)數(shù)據(jù)可視化。（注：實驗室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)即為本次試驗所用材料的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，轉(zhuǎn)錄組測序由華大基因完成）。

1.2.4 Real-Time PCR驗證煙堿代謝基因表達(dá)數(shù)據(jù)煙草葉片總RNA提取，參照寶生物RNAiso Plus（Total RNA提取試劑）試劑盒說明書進(jìn)行，凝膠電泳和超微量分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度，寶生物提供的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)用于RT-PCR反應(yīng)，將合成的cDNA稀釋10倍，常規(guī)PCR檢測cDNA質(zhì)量，選取高質(zhì)量cDNA為模板，定量分析煙堿代謝基因表達(dá)變化。

利用Premier Prime5.0軟件設(shè)計煙堿代謝相關(guān)基因的定量PCR引物（表1）。選用打頂后15、45、55、75 d葉片cDNA為模板，ABI 7500型實時熒光定量PCR儀進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)，3次技術(shù)重復(fù)，以打頂后15 d的葉片為單位1，采用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量，SPSS 22.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 煙草不同衰老時期葉片中生物堿含量分析

不同衰老時期葉片中生物堿含量（煙堿、去甲基煙堿、新煙草堿、麥斯明）如圖1所示?？梢钥闯觯瑹煵菟ダ铣墒爝^程中，葉片中生物堿各組分呈現(xiàn)上升趨勢，包括煙堿、新煙草堿、去甲基堿、麥斯明；衰老后期（75或85 d時），新煙草堿含量上升最明顯，增加了123.7%，煙堿、去甲基堿含量也有明顯提高，分別增加54.2%和42.7%，而麥斯明含量只有18.5%的提高，以上結(jié)果顯示葉片中生物堿含量隨著煙葉成熟衰老逐步積累。

2.2 葉片煙堿代謝基因表達(dá)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，檢索煙堿代謝相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用相應(yīng)的生物信息學(xué)軟件繪制基因表達(dá)差異圖（圖2）。共檢索到43個煙堿代謝相關(guān)基因，涉及煙堿合成、降解、轉(zhuǎn)運、以及遺傳調(diào)控等過程。圖2顯示，隨著煙葉成熟衰老，煙堿降解相關(guān)基因CYP82E2、CYP82E4上調(diào)表達(dá)，其中CYP82E2表達(dá)量上升6.2倍，CYP82E4上升2.9倍，而CYP82E10、CYP82E5v2表達(dá)量變化不大；煙堿合成基因主要包括ADC、ODC、BBL、MPO、QS、SPDS及其同源基因，其中BBL2表達(dá)量上調(diào)2.9倍，ODC2上調(diào)2.7倍，ADC1略上調(diào)，其他基因表達(dá)變化不明顯；煙堿轉(zhuǎn)運相關(guān)基因分別是JAT1、MATE2、NUP1，其中JAT1在衰老后期上調(diào)最明顯，表達(dá)量提高2.6倍，NUP1的表達(dá)模式類似于MATE2，在65 d時最高；煙堿代謝調(diào)控基因較多，包括COI、MYC、ORC、JAZ、MTHFR1、ERF32及其同源基因，其中COI2、COI3、MYC2、MYC3、JAZ1上調(diào)表達(dá)，而JAZ1、MYC2上調(diào)最明顯，約2.3倍，下調(diào)基因有MTHFR1、ORC3，其余基因未有明顯變化。圖2中基因表達(dá)變化說明煙堿代謝是通過多個基因協(xié)同調(diào)控實現(xiàn)的，相關(guān)基因表達(dá)變化趨勢同衰老葉片中煙堿、降煙堿含量變化規(guī)律基本一致。

表1 引物目錄Table1 Primers

圖1 打頂后不同時期葉片中的生物堿含量Fig.1 Alkaloid contents in leaves at different time points after topping

圖2 煙堿代謝相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)分析Fig.2 Expression of genes related to nicotine metabolism

2.3 Real-Time PCR表達(dá)數(shù)據(jù)分析

選取煙堿代謝關(guān)鍵基因（表1），以打頂后15、45、55、75 d葉片cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR，驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果如表2所示。定量PCR結(jié)果顯示，調(diào)控基因CYP82E4、CYP82E2在葉片衰老后期上調(diào)表達(dá)，75 d時表達(dá)量增加10.7倍；轉(zhuǎn)運蛋白基因JAT1在55 d時上調(diào)8.87倍，而NUP1在45 d時上調(diào)3.37倍，可能這一時期煙堿運輸活性最強；合成基因ADC1、ODC2、BBL2也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，且55 d時表達(dá)量達(dá)分別提高2.41、16.2和6.49倍，預(yù)示著葉片器官也可能參與了煙堿的合成；調(diào)控基因COI1、MYC3在55 d時表達(dá)量上升至15 d的13.8倍和3.77倍，JAZ1、MYC2在整個衰老時期上調(diào)表達(dá)，75 d時表達(dá)量分別增加3.5倍和4.55倍，MTHFR1下調(diào)顯著，75 d時表達(dá)量下降到原來的0.238倍，而ORC1變化不明顯；以上定量分析與本試驗轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果能夠真實地反映煙堿代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，這為煙堿代謝功能基因的發(fā)掘提供了有利的參考。

表2 煙堿主要代謝基因qRT-PCR驗證分析Table 2 Real-Time PCR verification of gene expression in nicotine metabolism

3 討論

煙堿合成的根特異性機制認(rèn)為，根部器官是煙堿合成的唯一部位，其他組織器官不具備合成煙堿的能力[5]；在衰老成熟過程中，參與煙堿轉(zhuǎn)運的蛋白基因JAT1、NUP1表達(dá)上調(diào)，NUP1將根部的煙堿運輸至葉片器官，再由JAT1轉(zhuǎn)運至液泡內(nèi)，從而使葉片中的煙堿含量增加，但轉(zhuǎn)錄組測序及定量驗證結(jié)果顯示，ADC1、ODC2、BBL2等煙堿合成基因在葉片衰老過程中表達(dá)水平明顯提高，暗示葉片中有可能存在某幾個煙堿合成催化反應(yīng)，如通過ADC1、ODC2促進(jìn)吡咯環(huán)生物合成或BBL2催化兩環(huán)的縮合途徑實現(xiàn)煙堿含量持續(xù)增加，促進(jìn)成熟葉片中的煙堿合成，但衰老葉片中是否存在煙堿合成還需進(jìn)一步驗證；生物堿含量分析結(jié)果表明，除煙堿外，其他生物堿及代謝中間產(chǎn)物如新煙草堿、降煙堿、麥斯明等在衰老葉片中不斷積累，而轉(zhuǎn)錄組和定量PCR分析結(jié)果顯示，煙堿轉(zhuǎn)化基因CYP82E2、CYP82E4表達(dá)持續(xù)增加，推測煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化主要通過CYP82E2、CYP82E4途徑來實現(xiàn)。

煙堿代謝是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，多個因子協(xié)同調(diào)節(jié)基因變化最終影響葉片中的煙堿含量。COI1蛋白能夠響應(yīng)JA信號，在26S蛋白酶體的作用下靶向降解JAZ蛋白，JAZ蛋白表達(dá)水平下降，從而激活JA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[14]，但轉(zhuǎn)錄組測序和定量驗證結(jié)果顯示，衰老后期JAZ1上調(diào)表達(dá)，說明衰老介導(dǎo)JAZ1調(diào)控?zé)焿A合成途徑不同于JA，其調(diào)控機制有待于進(jìn)一步研究；MTHFR1通常作為CYP82E4的轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控CYP82E4的轉(zhuǎn)錄[6]，試驗結(jié)果顯示，葉片衰老過程中，MTHFR1表達(dá)量降低，對CYP82E4的抑制作用減弱，從而使CYP82E4轉(zhuǎn)錄水平提高，有利于煙堿向降煙堿方向的轉(zhuǎn)化，這與之前的研究基本一致；ORC1過表達(dá)能提高煙堿的含量[16]，但ORC1調(diào)控?zé)焿A合成的機制尚不清楚，目前有研究指出ORC1響應(yīng)MeJA信號途經(jīng)，通過磷酸化途徑激活煙堿合成基因表達(dá)，定量分析結(jié)果顯示，ORC1在整個衰老過程中表達(dá)略微下調(diào)，表明除了轉(zhuǎn)錄水平外，衰老介導(dǎo)ORC1調(diào)控?zé)焿A合成途徑可能也有磷酸化過程的參與。

植物體內(nèi)的煙堿含量受環(huán)境因素影響，在一定范圍溫度能促進(jìn)葉片中煙堿積累[18]，肖金香等[19]對氣候生態(tài)因素影響烤煙品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，氣溫每上升1℃，煙堿可提高3.59 g/kg；金云峰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，成熟期生物堿的積累水平與生長溫度呈正相關(guān)關(guān)系，溫度上升能促進(jìn)煙堿向葉片中的轉(zhuǎn)移；與此相一致地，本試驗發(fā)現(xiàn)自然衰老的煙葉中煙堿含量穩(wěn)定上升，推測這一過程可能與植物所受溫度有關(guān)。不同栽培措施如打頂抹杈、施肥等對煙堿含量也有很大影響[2,20-21]，生產(chǎn)上打頂能促進(jìn)煙堿向葉部的轉(zhuǎn)移[22]，而氮肥能極大地提高煙堿的生物合成。不同的環(huán)境因素和栽培措施影響煙堿代謝的機制目前尚未弄清，猜測可能影響了煙堿合成或轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶基因表達(dá)而改變?nèi)~片煙堿含量，這一假設(shè)需要進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，煙草葉片成熟過程中生物堿含量不斷增加，包括煙堿、去甲基煙堿、新煙草堿、麥斯明；而煙堿作為生物堿最主要的部分，其含量在衰老過程中不斷提高。與煙堿含量增加相符的是，在煙葉衰老過程中，一些與煙堿運輸相關(guān)的蛋白基因上調(diào)表達(dá)，例如JAT1、NUP1等。同時進(jìn)入衰老期后，葉片中煙堿合成代謝基因表達(dá)量增加，例如ADC1、ODC2、BBL2及其同源基因，暗示著衰老后期葉片中可能存在煙堿合成。調(diào)控?zé)焿A代謝相關(guān)基因COI1、JAZ1、MYC2、MYC3表達(dá)上調(diào)，MTHFR1下調(diào)，表明葉片中的煙堿代謝是由多個因子協(xié)同調(diào)節(jié)完成的，存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制。本研究通過分析煙草衰老葉片煙堿代謝相關(guān)基因表達(dá)情況，探究煙葉成熟衰老過程煙堿代謝變化規(guī)律，為生產(chǎn)上改良煙葉品質(zhì)、選育優(yōu)良品種及減輕卷煙制品對健康的危害提供了理論參考。

[1]邱堯，周冀衡，黃劭理，等.打頂后氮素供應(yīng)和腋芽生長互作對烤煙煙堿積累的影響 [J].中國煙草科學(xué)，2016，37（4）：19-23.

[2]招啟柏，湯一卒，王廣志.烤煙煙堿合成及農(nóng)藝調(diào)節(jié)效應(yīng)研究進(jìn)展[J].中國煙草科學(xué)，2005，26（4）；19-22.

[3]SISSON V A,SEVERSON R F.Alkaloid composition of the Nicotiana species[J].Beitr?ge Zur Tabakforschung,2015,14(6):327-339.

[4]王威威，席飛虎，楊少峰，等.煙草煙堿合成代謝調(diào)控研究進(jìn)展[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2016，12（1）：62-67.[5]金云峰，李軍營，張建波，等.煙草煙堿代謝的生化和分子機制及其調(diào)控[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，4（4）：882-891.

[6]張洪博.煙草重要基因篇：3.煙草煙堿合成代謝相關(guān)基因 [J].中國煙草科學(xué)，2014，35（3）：117-120.

[7]NACONSIE M,KATO K,SHOJI T,et al.Molecular evolution of N-methylputrescine oxidase in tobacco[J].Plant&Cell Physiology,2014,55(2):436-444.

[8]KATOH A,UENOHARA K,AKITA M,et al.Early Steps in the Biosynthesis of NAD in Arabidopsis Start with Aspartate and Occurin the Plastid[J].Plant physiology,2006,141(3):851-857.

[9]DEBOER K D,LYE J C,AITKEN C D,et al.The A622 gene in Nicotiana glauca(tree tobacco):evidence for a functional role in pyridine alkaloid synthesis[J].Plant Molecular Biology,2009,69(3):299-312.

[10]KAJIKAWA M,SHOJIT,KATO A,etal.Vacuole-localized berberine bridge enzyme-like proteins are required for a late step of nicotine biosynthesis in tobacco[J].Plant physiology,2011,155(4):2010-2022.

[11]趙丹，秦利軍，孫洪榮，等.煙草CYP82E4v1基因調(diào)控降煙堿的生物合成[J].煙草科技，2014（8）：68-86.

[12]LEWIS R S,BOWEN S W,KEOGH M R,et al.Three nicotine demethylase genes mediate nornicotine biosynthesis inNicotiana tabacumL.:functional characterization of the CYP82E10 gene[J].Phytochemistry,2010,71(17):1988-1998.

[13]MORITA M,SHITAN N,SAWADA K,et al.Vacuolar transport of nicotine is mediated by a multidrug and toxic compound extrusion(MATE)transporter inNicotiana tabacum[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(7):2447-2452.

[14]王文靜，陳德鑫，張潔.煙草茉莉素信號途徑相關(guān)基因[J].中國煙草科學(xué)，2016，37（6）：101-104.

[15]SHOJI T,KAJIKAWA M,HASHIMOTO T.Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco[J].Plant Cell,2010,22(10):3390-3409.

[16]DE K B,TILLEMAN S,PAUWELSL,etal.APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR and basic helix-loop-helix tobacco transcription factors cooperatively mediate jasmonate-elicited nicotine biosynthesis[J].Plant Journal,2011,66(6):1053-1065.

[17]ZHANG H B,BOKOWIEC M T,RUSHTON P J,et al.Tobacco Transcription Factors NtMYC2a and NtMYC2b Form Nuclear Complexes with the NtJAZ1 Repressor and Regulate Multiple Jasmonate-Inducible Steps in Nicotine Biosynthesis[J].Molecular Plant,2012,5(1):73-84.

[18]金云峰，王莎莎，張建波，等.生長溫度對烤煙生物堿含量及煙堿代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響[J].熱帶作物學(xué)報，2016，37（3）：555-567.

[19]肖金香，劉正和，王燕，等.氣候生態(tài)因素對烤煙產(chǎn)量與品質(zhì)的影響及植煙措施研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，11（4）：158-160.

[20]劉國順，劉韶松，賈新成，等.煙田施用有機肥對土壤理化性狀和煙葉香氣成分含量的影響[J].中國煙草學(xué)報，2005，11（3）：29-33.

[21]劉華山，田效園，韓錦峰，等.煙草對機械傷害的響應(yīng)[J].中國煙草科學(xué)，2009，30（3）：58-62.

[22]張丹，劉國順，章建新，等.打頂時期對烤煙根系活力及煙堿積累規(guī)律的影響[J].中國煙草科學(xué)，2006，27（1）：38-41.