三七總皂苷對(duì)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究

龔春香 徐微微 邵馨

[摘要] 目的 探討三七總皂苷（PNS）對(duì)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。 方法 根據(jù)培養(yǎng)方法的不同將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、PNS低劑量組（15 mg/L）、PNS中劑量組（30 mg/L）和PNS高劑量組（60 mg/L）。采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，qRT-PCR及Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞miRNA-379-5p、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表達(dá)情況。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，PNS低、中、高劑量組中A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力均下降，miRNA-379-5p表達(dá)上調(diào)，MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；PNS中、高劑量組中MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)（P < 0.05）。 結(jié)論 PNS可抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與PNS上調(diào)A549細(xì)胞miRNA-379-5p表達(dá)和下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 三七總皂苷；侵襲；miRNA-379-5p；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

[中圖分類號(hào)] R73-37 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）10（a）-0017-04

The research on the effect and mechanism of Panax notoginseng saponins on invasion and metastasis of A549 cells

GONG Chunxiang XU Weiwei SHAO Xin

Pathology Department， Changzhou TCM Hospital， Jiangsu Province， Changzhou 213003， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Panax notoginseng saponins （PNS） on invasion and metastasis of A549 cells. Methods A549 cells were divided into control group， low dose of PNS group （15 mg/L）， medium dose of PNS group （30 mg/L）， high dose of PNS group （60 mg/L） according to different culture methods. Transwell cell invasion test was used to detect the invasion and metastasis ability of A549 cells， qRT-PCR and Western blot methods were used to detect the expression levels of miRNA-379-5p， matrix metalloproteinase （MMP）-2 and MMP-9 in A549 cells. Results Compared with control group， the invasion and metastasis ability of A549 cells of low， medium， high dose of PNS groups decreased， the expression of miRNA-379-5p increased， the expression of MMP-2 protein and mRNA decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）； the expression of MMP-9 protein and mRNA of medium and high dose of PNS groups decreased （P < 0.05）. Conclusion PNS could inhibit the invasion and metastasis of A549 cells， and its mechanism may be related to upregulation of miRNA-379-5p expression and downregulation of MMP-2 and MMP-9 expression in A549 cells induced by PNS.

[Key words] Panax notoginseng saponins； Invasion； miRNA-379-5p； Matrix metalloproteinase-2； Matrix metalloproteinase-9

肺癌患者5年生存率低，而轉(zhuǎn)移是決定肺癌患者預(yù)后的最關(guān)鍵因素。侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可溶解細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞之間黏附減弱，最終使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[1]。三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是五加科人參屬植物三七的提取物，是三七主要的生理活性成分，在抗缺氧、抗衰老、提高機(jī)體免疫力以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好的活性[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，PNS可抑制動(dòng)脈粥樣斑塊中MMP的表達(dá)[3]，提示其可能具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的活性。本研究以肺癌A549細(xì)胞株為研究對(duì)象，觀察不同濃度PNS對(duì)其侵襲能力及MMP表達(dá)的影響，探討PNS抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)：875603）和胎牛血清（批號(hào)：DPH1628）購(gòu)自HyClone公司；總RNA提取試劑盒（批號(hào)：D339702）購(gòu)自O(shè)MEGA公司；miRNeasy提取試劑盒（批號(hào)：133201741）購(gòu)自QIAGEN公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（批號(hào)：CK7132AB）購(gòu)自Takara公司；兔抗人MMP-2抗體（批號(hào)：AB37150）及兔抗人MMP-9抗體（批號(hào)：AB38898）購(gòu)自abcam公司；鼠抗人β-actin一抗（批號(hào)：160213）購(gòu)自Sigma公司；山羊抗鼠HRP-IgG（批號(hào)：161210）和山羊抗兔HRP-IgG（批號(hào)：151227）二抗購(gòu)自中杉公司；PNS（純度98%，批號(hào)：170318）購(gòu)自云南植物藥物有限公司；Matrigel膠（批號(hào)：356234）購(gòu)自美國(guó)BD公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.1.2 細(xì)胞 A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于24孔板中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分為四組：對(duì)照組、PNS低劑量組（15 mg/L）、PNS中劑量組（30 mg/L）、PNS高劑量組（60 mg/L）。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入DMSO（1∶1000），含藥組分別加入相應(yīng)濃度的PNS處理24 h。

1.2.2 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Matrigel膠用Opti-MEMI去血清培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋后，加入Transwell小室，每個(gè)小室50 μL，37℃溫箱中放置1 h，使其干成膠狀。用Opti-MEMI去血清培養(yǎng)基重懸消化好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液100 μL（1×104個(gè)細(xì)胞）加入已鋪Matrigel膠的小室中，PBS溶解PNS，濃度分別為1.5、3、6 g/L，取1 μL分別加入PNS低、中、高劑量組細(xì)胞懸液中。在下室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基600 μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽擦去膜上層的細(xì)胞，用95%酒精固定15 min后，用結(jié)晶紫染色，最后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)取6個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)各組的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá) 用OMEGA總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，按操作說明書進(jìn)行。MMP-9上游引物：5′-ACGCAGACATCGTCATCCAGT-3′，MMP-9下游引物：5′-GCACCACAACTCGCATCGTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度：126 bp，退火溫度：60℃；β-actin上游引物：5′-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3′，β-actin下游引物：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度：130 bp，退火溫度：59℃；MMP-2上游引物：5′-TGCCCAAGAATAGATGCTGAC-3′，MMP-2下游引物：5′-GAAAGGAGAAGAGCCTGAAGTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度：160 bp，退火溫度：60℃。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 qRT-PCR法檢測(cè)miRNA-379-5p表達(dá) 用QIAGEN的miRNeasy提取試劑盒提取各組細(xì)胞miRNA，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，miRNA-379-5p上游引物：5′-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3′，miRNA-379-5p下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，退火溫度：60℃。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，退火溫度：60℃。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 全細(xì)胞蛋白提取，BCA法蛋白定量，蛋白變性后取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h，1∶1000稀釋的MMP-2和MMP-9一抗4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜15 min×3次，用1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h后，TBST振搖洗膜15 min×3次。ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后以Image J軟件進(jìn)行條帶分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量PNS對(duì)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

與對(duì)照組比較，PNS低、中、高劑量組透膜細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。

2.2 不同劑量PNS對(duì)A549細(xì)胞miRNA-379-5p表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，PNS低、中、高劑量組均可上調(diào)A549細(xì)胞miRNA-379-5p表達(dá)（P < 0.05或P < 0.01）。

2.3 不同劑量PNS對(duì)A549細(xì)胞MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，PNS低、中、高劑量組A549細(xì)胞MMP-2的mRNA表達(dá)均下調(diào)（P < 0.05或P < 0.01），PNS中、高劑量組A549細(xì)胞MMP-9的mRNA表達(dá)均下調(diào)（P < 0.05），而PNS低劑量組A549細(xì)胞MMP-9的mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2～3。

2.4 不同劑量PNS對(duì)A549細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，PNS低、中、高劑量組A549細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P < 0.05或P < 0.01），PNS中、高劑量組A549細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)亦顯著下調(diào)（P < 0.05），低劑量組A549細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，PNS可抗腫瘤，其可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，還可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，起到抗腫瘤作用[4-8]。但PNS對(duì)腫瘤尤其是肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響研究甚少，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)其可抑制動(dòng)脈粥樣斑塊中MMP的表達(dá)，筆者推測(cè)，PNS可能具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移活性。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)復(fù)雜的生物學(xué)過程，其涉及多因素、多水平的調(diào)節(jié)。MMP是降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的酶類，能降解細(xì)胞外基質(zhì)的許多成分，導(dǎo)致腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[9-11]。MMP是一個(gè)非常龐大的家族，由20多個(gè)具有獨(dú)特底物和多樣性功能成員組成。根據(jù)催化底物的不同將MMP分為5類，MMP-2和MMP-9屬于Ⅳ型膠原酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜主要結(jié)構(gòu)蛋白Ⅳ型膠原，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起非常重要的作用。此外，多種miRNA與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-15]。既往研究表明，miR-379-5p在抑制腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，其可抑制腫瘤細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)[16-20]，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。

本研究選取肺癌A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，研究了PNS對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制，結(jié)果顯示，PNS具有顯著抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力、顯著抑制A549細(xì)胞MMP-2和MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)以及顯著促進(jìn)miRNA-379-5p表達(dá)的作用。本研究結(jié)果提示，PNS具有抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，其作用機(jī)制與其抑制腫瘤細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)有關(guān)，而其對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制可能與其促進(jìn)miRNA-379-5p表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。

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（收稿日期：2018-06-06 本文編輯：張瑜杰）