重組IFN-γ免疫后紅鰭東方鲀免疫相關(guān)基因在腎組織中的表達(dá)分析

孔德榮 孫鶴 李慧 王智誠 仇雪梅 劉海映 王秀利

摘 要：?? 為探討重組紅鰭東方鲀（ Takifugu rubripes ）干擾素γ（rIFNg-γ）對機體的免疫應(yīng)答，以不同濃度（25 μg/mL rIFNg-γ為實驗組1、50 μg/mL rIFNg-γ為實驗組2）的原核表達(dá)的IFN-γ重組蛋白免疫6月齡健康紅鰭東方鲀，PBS作為對照組，于腹腔注射后6、12、24、36 h取腎臟組織。實時定量PCR檢測腎組織IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因在腎臟組織不同時間表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀經(jīng)rIFNg-γ免疫后6～36 h，IFN-α基因在實驗組1中的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，24 h時表達(dá)量最高;在實驗組2中的表達(dá)量在6 h最高，隨后呈下降趨勢。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6 h表達(dá)量都出現(xiàn)最大值且實驗組1高于實驗組2，隨后呈下降趨勢。Mx1基因的表達(dá)則出現(xiàn)上升趨勢，24 h時表達(dá)量最高，隨后下降。

關(guān)鍵詞： 紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）;腎臟;重組干擾素γ;免疫相關(guān)基因;基因表達(dá)

我國養(yǎng)殖紅鰭東方鲀（ Takifugu rubripes ）已有二十余年，人工繁殖、育苗、養(yǎng)成技術(shù)基本成熟。但隨著紅鰭東方鲀養(yǎng)殖規(guī)模及養(yǎng)殖密度的不斷擴大，病害問題日趨嚴(yán)重，造成了較大的經(jīng)濟損失。尤其是細(xì)菌性疾病、病毒性疾病等 ?[1] 流行范圍廣、發(fā)生頻繁、死亡率高，在一定程度上制約了紅鰭東方鲀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

利用本課題組前期構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)并小批量制備的重組紅鰭東方鲀IFN-γ，免疫紅鰭東方鲀，檢測免疫相關(guān)基因IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ（主要組織相容性復(fù)合體I基因（ Major histocompatibility complex classⅠ，MHCⅠ））、Mx1（黏病毒耐藥蛋白1）在腎組織的表達(dá)情況，為重組紅鰭東方鲀IFN-γ作為魚類免疫增強劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與實驗設(shè)計

實驗用紅鰭東方鲀購自大連天正實業(yè)有限公司養(yǎng)殖場，體重150±20 g，體長16～18 cm，實驗前于連續(xù)充氣的水槽中暫養(yǎng)2周，水溫15～18 ℃，每天投餌2次，其他按常規(guī)管理。暫養(yǎng)后，紅鰭東方鲀隨機分成3組，每組75尾，以PBS（pH=7.4） 緩沖液為溶劑，將原核表達(dá)的紅鰭東方鲀IFN-γ重組蛋白（rIFN-γ）制成終濃度分別為25 μg/mL、50 μg/mL的溶液。三組個體分別腹腔注射PBS緩沖液、25 μg/mL rIFNg-γ、50 μg/mL rIFNg-γ各200 μL，其中PBS組為陰性對照，25 μg/mL rIFNg-γ組為實驗組1，50 μg/mL rIFNg-γ組為實驗組2。處理后，分別于0、6、12、24、36 h取3個組紅鰭東方鲀腎臟組織。將采取的腎組織樣按照1：5（v/v） 比例放入RNA later中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗藥品

RNAiso plus試劑，Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物生物有限公司; DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程（上海）有限公司; ?TransStart ?Top Green qPCR Supermix 試劑盒等購自北京全式金生物科技公司。Ambion RNAlater 購自賽默飛世爾科技有限公司，其他分析純藥品等均購自大連辰鈺生物公司。

1.3 免疫基因及其引物設(shè)計

以紅鰭東方鲀β-actin基因作為內(nèi)參基因，選取紅鰭東方鲀IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx等免疫基因，分析紅鰭東方鲀注射重組IFN-γ蛋白后這些免疫基因表達(dá)量的變化情況。利用Primer 5進行內(nèi)參基因和免疫基因的引物設(shè)計，設(shè)計好的引物由上海生物工程有限公司進行合成（表1）。

1.4 總RNA的提取

將同一組織、同一實驗組、相同時間點的樣品于液氮中混勻后充分研磨并分裝，-80 ℃保存，用于總RNA提取實驗。參照RNAiso plus說明書進行RNA提取。瓊脂糖凝膠電泳初步測定總RNA完整性，分光光度計及Aligent2000測定總RNA濃度及純度。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

選取OD 260 /OD 280 =1.8～2.0的RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物生物有限公司）說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA第一鏈，具體反應(yīng)體系（表2）及反應(yīng)條件如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.6 實時定量PCR

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ?以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進行實時定量PCR實驗。按照5點10倍稀釋法將cDNA進行稀釋用作制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。實驗時選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線法，利用全式金 TransStart ? Top Green qPCR SuperMix試劑盒在ABI Step One Plus上進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：即模板1 μL，正反向引物各0.6 μL（引物濃度10 μm/L），buffer 10 μL，Dye 0.4 μL，Rnase Free dH2O 7.4 μL。每個樣品3次重復(fù)，反應(yīng)條件為：94 ℃，30 s;94 ℃，5 s;60 ℃，30 s。觀察熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定Ct值。

1.6.2 相對定量PCR及數(shù)據(jù)處理 ?取上述cDNA為模板，以β-actin基因為內(nèi)參，進行相對定量PCR。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同1.6.1。采用2-△△Ct法計算同一基因在不同組織的表達(dá)情況，實驗結(jié)束后將數(shù)據(jù)輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

瓊脂糖凝膠電泳初步檢測總RNA提取效果，結(jié)果如圖1所示，28 S、18 S條帶清晰且28 S條帶亮度約是18 S亮度的1～2倍。分光光度計測定組織總RNA OD 230nm 、 OD 260nm 、OD 280nm ，確定總RNA濃度（OD 260nm / OD 280nm =1.8～2.0） 及純度（OD 260nm / OD 230nm =1.5～2.0） 滿足后續(xù)實驗要求。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將總RNA轉(zhuǎn)變成cDNA第一鏈，瓊脂糖電泳檢測條帶呈彌散狀。

2.2 實時定量PCR檢測

實時定量PCR制作β-actin、IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，結(jié)果顯示5個基因的溶解曲線分別在88.27 ℃、85.13 ℃、87.82 ℃、82.25 ℃、83.54 ℃有單一峰且無雜峰，說明引物均具有良好的特異性，如圖2所示，滿足實時定量PCR的要求。

觀察各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表模板相對濃度即稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值，反映了基因出現(xiàn)擴增時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通過調(diào)整cDNA的濃度，各基因擴增效率均達(dá)到90%～110%，R 2均大于0.998，可以認(rèn)為各基因與內(nèi)參基因擴增效率一致，滿足相對定量PCR中2 ?-△△Ct 法原理及要求。

2.3 免疫基因的組織表達(dá)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中各免疫基因各cDNA濃度時Ct值的大小，選擇10 ?-1 cDNA濃度為模板進行各免疫基因相對定量PCR實驗（2 ?-△△Ct 法）。如圖3所示，紅鰭東方鲀免疫后6～36 h，IFN-α基因在實驗組1中的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，24 h時表達(dá)量最高;在實驗組2中的表達(dá)量在6 h最高，隨后呈下降趨勢。IFN-γ、MHCⅠ基因在免疫后6 h表達(dá)量都出現(xiàn)最大值且實驗組1高于實驗組2，隨后呈下降趨勢。Mx基因的表達(dá)則出現(xiàn)上升趨勢，24 h時表達(dá)量最高，隨后下降。

3 討論

經(jīng)重組的紅鰭東方鲀IFN-γ免疫后個體后，IFN-α基因的表達(dá)量在低劑量組中呈先上升后下降的趨勢，在24 h表達(dá)量相對較高，而高劑量組中其在6h表達(dá)量最高，表明高劑量組效果更好。余新建等 ?[2] 利用重組Ⅰ型干擾素免疫健康草魚，分別于免疫后6、12、24、48、72 h檢測草魚各免疫器官內(nèi)干擾素系統(tǒng)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明Ⅰ型IFN表達(dá)在24～48 h達(dá)到峰值，該結(jié)果與本實驗結(jié)果相似，但本實驗IFN-α表達(dá)量在36 h出現(xiàn)下降，可能是由于重組蛋白濃度及活性下降引起的。

IFN-γ的表達(dá)量在低劑量及高劑量組中均在6 h出現(xiàn)峰值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。該結(jié)果說明紅鰭東方鲀受到重組IFN-γ蛋白免疫后，體內(nèi)IFN-γ表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過一段時間后，免疫作用結(jié)束，IFN-γ表達(dá)逐漸恢復(fù)到本底水平。Jung ?[3] 等以10 ng/mL 和100 ng/mL牙鲆重組IFN-γ蛋白免疫其頭腎細(xì)胞，體外培養(yǎng)后檢測IL-1β、STAT1、CXCL13、IFN-γ在6 h、24 h的表達(dá)情況;結(jié)果顯示高劑量組中IFN-γ基因在6 h表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低劑量組和對照組，低劑量組在24 h時有顯著性表達(dá)，該結(jié)果表明當(dāng)重組蛋白濃度大于100 ng/mL時，可能會引起細(xì)胞內(nèi)IFN-γ基因的大量表達(dá)。Biswas等（2015）以50 μg/mL濃度的重組蛋白免疫紅鰭東方鲀檢測機體內(nèi)IFN-γ、IL-1β、IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子在1 d、3 d、5 d時的表達(dá)情況，結(jié)果顯示IFN-γ的表達(dá)沒有顯著性變化，而IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子在1d、5d時的表達(dá)有顯著性差異，猜測IFN-γ會刺激免疫因子的不持續(xù)性表達(dá) ?[4] 。本實驗中IFN-γ基因在高劑量組（50 μg/mL） 的表達(dá)量普遍低于低劑量組，可能是由于重組蛋白濃度過高抑制基因的短時間內(nèi)的表達(dá)，對于其長遠(yuǎn)的影響需要進一步的研究探索。

MHC為主要組織相容性復(fù)合體，在特異性免疫中發(fā)揮重要作用，魚類與哺乳動物相同均含有兩類MHC分子即MHCⅠ和MHCⅡ。當(dāng)受到外源性物質(zhì)（如病毒、細(xì)菌、其他抗原等）刺激后，機體各組織內(nèi)的MHC分子會出現(xiàn)不同水平的上調(diào)。草魚注射柱狀黃桿菌后，其頭腎中的MHCⅠ顯著性上調(diào) ?[5] 。牙鲆受愛德華氏菌感染后免疫器官中的兩類MHC分子表達(dá)量均升高 ?[6] 。本實驗中，兩劑量組中MHCⅠ基因的表達(dá)量趨勢一致，在6 h表達(dá)量最高，且低劑量組高于高劑量組，隨后呈下降趨勢。這種現(xiàn)象可能與MHCⅠ本身的作用機制有關(guān)。MHCⅠ的主要作用是將抗原呈遞給CD +8T細(xì)胞，而CD +8T細(xì)胞具有具有抑制性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞作用 ?[7] ，在識別外源抗體，細(xì)胞攻毒方面起著重要作用。此外MHCⅠ可通過免疫細(xì)胞廣泛存在的模式識別信號通路而快速傳遞信息 ?[8] ，因此，在受到外源刺激后，紅鰭東方鲀個體內(nèi)MHCⅠ的表達(dá)量可能快速上調(diào)。

Mx蛋白是一種由IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的GTP酶動力蛋白，目前，魚類中已從大菱鲆 ?[9] 、大西洋鮭 ?[10] 、虹鱒 ?[11] 、鯰魚 ?[12] 獲得了具有抗病毒活性的Mx蛋白。研究表明，利用poly：C感染鯰魚會引起Mx mRNA顯著上調(diào)，肌肉注射后6 h出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的增加 ?[12] 。本實驗中Mx基因表達(dá)量在免疫后6～24 h表現(xiàn)為上調(diào)狀態(tài)，24 h表達(dá)量最大，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，低劑量組表達(dá)量總體高于高劑量組。本實驗證明重組IFN-γ可以作用于紅鰭東方鲀誘導(dǎo)其體內(nèi)Mx基因的表達(dá)。以病毒感染魚類，免疫印跡方式檢測Mx蛋白在不同器官的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫器官在病毒刺激后Mx蛋白表達(dá)量都會增加，但肝臟中Mx蛋白的表達(dá)量在注射處理后的第三天達(dá)到峰值，第14天仍保持上升狀態(tài) ?[13] ，表明Mx蛋白的表達(dá)量較為持久。

利用魚類的天然免疫基因生產(chǎn)和制備重組免疫因子作為免疫增強劑取代抗生素用于水產(chǎn)生物病害的防治是重要的研究內(nèi)容和發(fā)展方向。本研究結(jié)果為今后進一步研究重組免疫因子在魚類尤其是紅鰭東方鲀病害防治上的應(yīng)用提供了參考。

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