嘌呤核苷磷酸化酶的表達及其在啤酒中的應(yīng)用

李玉淼 ， 朱德偉 ， 朱洪康 ， 孫軍勇 ， 陸 健 *，4

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；4.宿遷市江南大學 產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇 宿遷 223800）

啤酒是以麥芽為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵而成的低乙醇飲料，含有豐富的營養(yǎng)物[1]，這其中也含有大量的嘌呤類物質(zhì)（purines）[2]。這些嘌呤類物質(zhì)主要來自麥芽，此外發(fā)酵后期酵母自溶也會產(chǎn)生少量嘌呤[3]。啤酒中嘌呤類物質(zhì)包括嘌呤核苷酸、結(jié)合態(tài)的嘌呤核苷和游離態(tài)的嘌呤堿基，酵母能且只能利用游離態(tài)的嘌呤堿基[4]。

嘌呤進入人體后代謝為尿酸，正常人體內(nèi)尿酸是1 000～1 200 mg。如果每天尿酸的生成和排泄量相當，人體內(nèi)尿酸代謝處于一種平衡狀態(tài)；但若排泄不足或者生成過剩，就會使體內(nèi)尿酸含量過高，從而導致高尿酸血癥[5]。醫(yī)學觀點認為高尿酸血癥是痛風發(fā)生的基礎(chǔ)，而啤酒是誘發(fā)痛風的一個因素。它主要表現(xiàn)在兩方面，一是啤酒中含有大量的尿酸前體嘌呤類物質(zhì)；二是乙醇對尿酸的形成有重要的影響。但是，盡管乙醇也影響血漿中尿酸的水平，啤酒中的嘌呤卻起著主要的作用[6]。

通過對市售啤酒的大量檢測，結(jié)果表明啤酒中主體嘌呤物質(zhì)為嘌呤核苷[7]。啤酒釀造過程中，經(jīng)糖化工藝制得的麥汁含有大量的嘌呤核苷和游離嘌呤堿基，這些嘌呤類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵工藝，由于酵母能且只能利用游離態(tài)的嘌呤堿基，僅有部分的游離嘌呤被酵母利用，剩余的嘌呤類物質(zhì)仍然存在于啤酒中。而嘌呤核苷磷酸化酶能夠?qū)Ⅺ溨械泥堰屎塑辗纸鉃橛坞x嘌呤堿基，嘌呤核苷含量降低，同時在發(fā)酵過程中，更多的游離嘌呤堿基為酵母所利用，最終提高了嘌呤類物質(zhì)的利用率，達到最大程度的降低啤酒中的嘌呤含量[8]。但是，目前市場上嘌呤核苷磷酸化酶的使用成本較高，平均320元/mg。因此，開發(fā)能用于啤酒釀造、價格合理的嘌呤核苷磷酸化酶將具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與材料 LB/Kanr液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，另加入50 μg/mL卡那霉素。

PCR引物：上海生工生物工程有限公司合成；TaqRDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶、IPTG：均購自上海生工生物工程有限公司；嘌呤核苷磷酸化酶（200 U/mg）：購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；大麥麥芽、Matcalfe：中糧麥芽（江陰）有限公司；腺嘌呤堿基（Adenine，A）、鳥嘌呤堿基 （Guanine，G）、 次黃嘌呤堿基（Hypoxanthine，H）、黃嘌呤堿基（Xanthine，X）：購自 Sigma 公司；次黃嘌呤核苷（肌苷 Inosine，Ino）：購自上海笛柏試劑公司。

1.1.2 儀器 EBC-LF型標準麥芽粉碎儀：北京德之杰啤酒技術(shù)有限公司；YQ-PJ-6B型全自動糖化儀：輕工業(yè)所西安輕機所光電公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；SCIENTZ JY 92-11超聲波細胞粉碎儀；瓊脂糖凝膠電泳儀、垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司；JD-801凝膠成像儀：江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌JM109和BL21（DE3），載體 pET-28a（+）和 pMD18-T：均為作者所在實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計和PCR擴增 根據(jù)PNPase基因的核苷酸序列設(shè)計一對引物[9]，分別在上游引物3′端和下游引物的5′端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點，其中：

上游引物為 5′-CGCGGATCCATGGCTACCC-3′

下游引物為 5′-CCCAAGCTTCTCTTTATCGCC CAG-3′

用以上引物擴增編碼PNPase的基因，反應(yīng)條件如下：95℃預變性 5 min，94℃變性 1 min，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)，結(jié)束后72℃延伸5 min用來補平DNA末端。

1.2.2 克隆載體和表達載體的構(gòu)建 利用T4 DNA連接酶將PCR擴增的產(chǎn)物與載體pMD18-T進行連接，所獲產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli JM109中，挑取平板上生長正常的菌落，堿法提取。以空載體質(zhì)粒為對照，電泳檢測轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，對初步確定有外源基因進入的質(zhì)粒送樣進行測序分析。

將表達載體pET-28a（+）和重組pMD18-T載體分別用HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切后連接，所獲連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）中。提取重組質(zhì)粒，以空載體質(zhì)粒為對照進行電泳。對初步確定有外源基因進入的質(zhì)粒進行酶切鑒定，篩選陽性克隆。

1.2.3 目的蛋白質(zhì)的誘導表達 取含有pET-28a（+）重組子的BL21菌落，于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，以此作為種子液。按1%的接種比例轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6，此時加入異丙基-β-硫代半乳糖苷，30℃繼續(xù)誘導表達4 h。

取誘導后的菌液進行離心，用預冷的破胞液重懸菌體沉淀，按功率200 W，工作5 s間歇5 s進行超聲波破碎，過后取細胞裂解液于4℃下12 000 r/min離心20 min，回收上清液則為粗酶。

1.2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)測定 測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)采用Bradford法，以牛血清白蛋白溶液做標準液，制作標準曲線[10]。

1.2.5 蛋白質(zhì)SDS-PAGE 分離膠為12 g/dL，濃縮膠為5 g/dL，將凝膠裝到電泳裝置上，加入電泳緩沖液。開始時電壓為60 V，待樣品變成一條直線進入分離膠后調(diào)為80 V，觀察凝膠板上的樣品溴酚藍條帶走至近底端時，停止電泳。電泳結(jié)束后經(jīng)固定液固定0.5 h，考馬斯亮藍染色1 h，最后用甲醇∶乙酸∶水（1∶1∶8）的脫色液脫色約 5 h 即可。

1.2.6 高效液相色譜（HPLC）檢測[11-12]色譜操作條件：色譜柱 Waters T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：KH2PO4-H3PO4pH 4.0；紫外檢測器波長：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

1.2.7 酶活性測 反應(yīng)體系：2 mL反應(yīng)液（2 mmol/L 肌苷，50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.5）于 60 ℃水浴預熱5 min，加入10 μL酶液反應(yīng)，結(jié)束后立即煮沸5 min滅酶，用HPLC測定反應(yīng)液中次黃嘌呤的增加值[13]。

PNPase的酶活單位定義為：在上述反應(yīng)后，每分鐘產(chǎn)生1 μmol次黃嘌呤所需的酶量。

1.2.8 樣品前處理[14]樣品中游離嘌呤堿基測定前處理方法：麥汁超聲除氣后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液進行高效液相色譜檢測[14]。

樣品中總嘌呤堿基測定前處理方法：準確吸取10 mL麥汁，加入0.5 mL的70%高氯酸，混勻，沸水浴1 h后迅速進行冰浴冷卻，用NaOH溶液調(diào)至中性。使用中速濾紙濾去沉淀物，將溶液定容至50 mL，再用稀磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0，0.22 μm濾膜過濾。

1.2.9 麥汁糖化工藝曲線 糖化開始時，分別向糖化醪液中添加商品嘌呤核苷磷酸化酶0.032 U/mL、相同活力的經(jīng)12 000 r/min離心20 min后回收的粗酶液，待糖化結(jié)束后比較嘌呤核苷磷酸化酶對麥汁中嘌呤類物質(zhì)含量的影響，見圖1。

圖1 糖化工藝曲線Fig.1 Profile of mashing

2 結(jié)果與分析

2.1 PNPase目的基因的擴增和測序

按照1.2.1的方法，以大腸桿菌DNA為模板、基于引物引導新鏈合成，成功擴增了PNPase目的基因。圖2顯示獲得大小約720 bp的特異性條帶。將擴增成功的條帶經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收，通過T4 DNA連接酶與pMD18-T克隆載體進行連接。利用E.coli JM109感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化實驗，過后隨機挑取平板上正常生長的菌落，堿法提取。瓊脂糖電泳檢測轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，對初步確定有外源基因進入的質(zhì)粒送樣進行測序分析，測序結(jié)果表明正確。

圖2PCR擴增deoDFig.2 PCR amplification of deoD

2.2 表達載體的構(gòu)建、篩選和鑒定

用HindⅢ、BamHⅠ雙酶切克隆載體pMD18-T上的PNPase基因和表達載體pET-28a（+），連接，得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中。從菌液中少量提取質(zhì)粒，以空載體質(zhì)粒為對照進行電泳，從質(zhì)粒大小上初步確定有外源基因進入載體。

HindⅢ、BamHⅠ雙酶切鑒定片段大小，根據(jù)酶切后片段的數(shù)目及大小確認目的基因是否正確連上。圖3顯示酶切結(jié)果與預期大小一致。

圖3 pET-28a（+）-deoD雙酶切結(jié)果Fig.3 Plasmid pET-28a （+）-deoD digested by double enzymes

2.3 大腸桿菌中重組質(zhì)粒的表達分析

圖4為經(jīng)超聲波破碎后的細胞裂解液SDSPAGE 分析圖。 以 E.coli BL21（pET-28（+））為對照，重組菌在28 000左右明顯增加了表達條帶，送樣鑒定確為表達產(chǎn)物PNPase。同時分析結(jié)果顯示，隨著誘導時間的延長，蛋白質(zhì)表達量隨之增加；誘導產(chǎn)物有少量分泌到培養(yǎng)基上清液中，但主要以胞內(nèi)可溶蛋白形式存在，且胞內(nèi)可溶蛋白質(zhì)中PNPase約占59%。

圖4 重組菌中deoD表達的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE result of expression product of deoD

2.4 重組PNPase的酶活力分析

對影響PNPase表達的因素，如培養(yǎng)溫度、誘導劑濃度、誘導時機、誘導后培養(yǎng)時間進行了分析，初步確定為培養(yǎng)溫度30℃、誘導劑濃度0.05 mmol/L、在對數(shù)生長期中期誘導表達以及誘導后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

按1.2.7酶活性測定方法，對經(jīng)上述優(yōu)化后獲得的酶液進行酶活測定。重組菌誘導4 h后PNPase活力為184.46 U/mL，對照菌酶活力為11.39 U/mL，重組菌相對應(yīng)的酶活力要顯著高于對照菌[16]。

2.5 糖化后麥汁中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度的測定

采用1.2.6的檢測方法對糖化工藝所制的麥汁中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度進行測定，結(jié)果見表1。

由表1可知，相比空白麥汁，添加商品酶的麥汁中游離嘌呤堿基總量從30.03 mg/L升高至44.98 mg/L，增加49.78%；添加自制粗酶的麥汁中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度從30.03 mg/L升高至40.10 mg/L，增加33.53%，效果類似，并且處理后的麥汁中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度增高。這說明通過PNPase的添加，可有效分解麥汁中的嘌呤核苷，進而提高麥汁中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度。

表1 大麥麥芽麥汁中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度的測定Table 1 Determination of free purine bases in wort of barley malts （mg/L）

2.6 發(fā)酵液中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度的測定

采用1.2.6的檢測方法對發(fā)酵液中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度進行測定，結(jié)果見表2。

由表2可知，空白發(fā)酵液中游離嘌呤質(zhì)量濃度為9.83 mg/L，與空白麥汁中游離嘌呤為30.03 mg/L對比，酵母可吸收利用20.2 mg/L游離堿基；相類似，添加商品酶的發(fā)酵液中游離嘌呤總量為8.02 mg/L，與添加商品酶的麥汁中游離嘌呤為44.98 mg/L相比，酵母吸收利用36.96 mg/L游離堿基；添加自制粗酶的發(fā)酵液中游離嘌呤總量為8.12 mg/L，與添加自制粗酶的麥汁中游離嘌呤為40.10 mg/L相比，酵母可利用31.98 mg/L游離堿基。這說明使用部分嘌呤核苷被分解的麥汁進行啤酒發(fā)酵，酵母可以吸收利用更多的游離嘌呤堿基，提高了嘌呤類物質(zhì)的利用率。

表2 發(fā)酵液中游離嘌呤堿基質(zhì)量濃度的測定Table 2 Determination of free purine bases in fermentation broth （mg/L）

2.7 發(fā)酵液中總嘌呤質(zhì)量濃度的測定

采用1.2.6的檢測方法對發(fā)酵液中總嘌呤質(zhì)量濃度進行測定，結(jié)果見表3。

由表3可知，相比空白發(fā)酵液，添加商品酶的發(fā)酵液中總嘌呤從77.45 mg/L降至50.65 mg/L，降低34.60%；添加自制粗酶的發(fā)酵液中總嘌呤堿基總量從77.45 mg/L降至54.85 mg/L，降低29.18%。這說明通過PNPase的添加，嘌呤核苷在糖化階段被部分分解，同時生成的游離嘌呤堿基與麥汁中原本存在的游離嘌呤堿基，在發(fā)酵階段被酵母吸收利用，最終導致啤酒中總嘌呤含量（嘌呤核苷+游離嘌呤堿基）降低，這一結(jié)論可以為低嘌呤啤酒的生產(chǎn)提供依據(jù)。

表3 發(fā)酵液中總嘌呤質(zhì)量濃度的測定Table 3 Determination of total purines in fermentation broth （mg/L）

3 結(jié)語

利用基因工程的技術(shù)手段在大腸桿菌中表達PNPase基因，在一定表達量的基礎(chǔ)上，測定重組菌的酶活性。將其初步應(yīng)用于啤酒的糖化工藝，使糖化工藝階段中游離嘌呤堿基含量大幅度增加，顯示構(gòu)建的重組菌具有很好的應(yīng)用價值。同時也發(fā)現(xiàn)在啤酒發(fā)酵過程中更多的游離嘌呤堿基可以為酵母所利用，較大程度的降低啤酒中的嘌呤質(zhì)量濃度，為低嘌呤啤酒的生產(chǎn)提供方法。

本研究中，所釀啤酒用原料為全麥芽，且糖化及發(fā)酵工藝尚未進行優(yōu)化，所獲空白發(fā)酵液中總嘌呤質(zhì)量濃度為77.45 mg/L。后續(xù)試驗將結(jié)合酶的作用以及調(diào)整配料、糖化工藝、發(fā)酵工藝，預期獲得低嘌呤啤酒。

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