杏鮑菇提取物對小鼠巨噬細(xì)胞免疫活性的研究

樊銘聰 ， 李文香 *， 胡欣蕾 ， 孫亞男 ， 于 戈

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），俗稱刺芹側(cè)耳，隸屬于真菌門，擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬[1]，是一種藥食皆宜的珍稀真菌。因其質(zhì)地脆嫩，肉質(zhì)肥厚，口感極佳，滑脆爽口，兼具杏仁和鮑魚的風(fēng)味而深受廣大消費者喜愛，故又有“平菇王”、“雪茸”的美譽[2]。

杏鮑菇不僅是營養(yǎng)價值高的美味食材，還是一種具有眾多生物活性物質(zhì)的保健食品，經(jīng)常食用杏鮑菇可起到提高免疫力、防癌抗癌[3]、降血壓、降血脂[4]、降血糖[5]、保肝、抗氧化[6]等多種功效。近年來，國內(nèi)外專家學(xué)者在研究杏鮑菇生物活性及其活性物質(zhì)方面已做了大量研究，除了發(fā)現(xiàn)具有廣譜生物活性的β-葡聚糖[7]外，也發(fā)現(xiàn)了一些具有不同保健功能的生物活性物質(zhì)。Wasser和Weis[8]從杏鮑菇中分離出一種名為Lovastatin的蛋白類降血脂藥物。Wang和Ng[9-11]發(fā)現(xiàn)了2種小分子多肽Pleureryn和Eryngin，具有良好的抗菌、抗病毒功效；此外，該學(xué)者還分離出具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒功能的熱穩(wěn)定性核糖核酸酶。目前，國內(nèi)外針對杏鮑菇的活性研究多集中在多糖和活性蛋白質(zhì)領(lǐng)域，僅有少量研究涉及杏鮑菇有機(jī)溶劑萃取物活性。據(jù)文獻(xiàn)研究報道，杏鮑菇不同極性提取物均具有良好的生物活性，其中，杏鮑菇醇提物能夠起到提高小鼠抗炎和免疫機(jī)能[12]，抗骨質(zhì)疏松[13]的作用；杏鮑菇氯仿提取物則有良好的抗癌效果[14]。然而，對于系統(tǒng)比較杏鮑菇不同極性提取物活性的研究至今仍未見報道，因此，針對杏鮑菇不同極性提取物的生物活性研究，對探明杏鮑菇生物活性及其作用機(jī)理具有重要意義。

本研究利用不同極性溶劑對杏鮑菇中生物活性成分進(jìn)行廣泛萃取，以小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1為受試細(xì)胞，對各提取物（PEs）的體外免疫活性進(jìn)行研究，試圖篩選出一種能夠較好地促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)免疫細(xì)胞因子分泌、提高吞噬活性的活性成分，并對其最佳作用濃度和最佳作用時間進(jìn)行了探討，為杏鮑菇活性成分分析與杏鮑菇功能性食品或藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 主要材料 杏鮑菇，購自青島市城陽區(qū)大潤發(fā)超市；小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1，購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 脂多糖 （LPS），購于美國Sigma公司；胎牛血清（FBS），購于美國Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液，購于美國Thermo scientific公司；四甲基噻唑藍(lán)（MTT）、臺盼藍(lán)，購于美國Sigma公司；鼠源TNF-α、IL-6 Elisa試劑盒、鼠源TLR2、TLR4試劑盒，購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、二甲基亞砜、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，均為國產(chǎn)分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 MCO-18AICCO2培養(yǎng)箱，購于日本Sanyo公司；CKX-41倒置顯微鏡，購于日本Olympus公司；Elx808自動酶標(biāo)儀，購于美國Bio-Tek公司；超凈工作臺，購于蘇州凈化設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī)，購于德國Christ公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 杏鮑菇提取物（PEs）制備 杏鮑菇子實體冷凍干燥粉末1.0 kg，用5 000 mL石油醚（30～60℃）50℃回流提取3次，每次12 h，減壓濃縮，冷凍干燥得到石油醚浸膏（PEP）13.4 g（白色油脂狀）；殘渣用5 000 mL氯仿，50℃回流提取3次，每次12 h，減壓濃縮，冷凍干燥得到氯仿浸膏（PEC）15.5 g（淺黃色油脂狀）；殘渣用5 000 mL乙酸乙酯，50℃回流提取3次，每次12 h，減壓濃縮，冷凍干燥得到乙酸乙酯浸膏（PEE）5.8 g（金黃色油脂狀）；殘渣用5 000 mL甲醇，50℃回流提取3次，每次12 h，減壓濃縮，冷凍干燥得到甲醇浸膏（PEM）98.1 g（金黃色固體）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1接種在RPMI-1640培養(yǎng)基中 （含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 IU青霉素和l00 μg/mL鏈霉素），與37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞濃度達(dá)到107/mL時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，保持細(xì)胞在指數(shù)增生期生長狀態(tài)。

1.2.3 PE對細(xì)胞存活率的影響 參考谷鴻喜[15]的方法，并稍做修改，取對數(shù)生長期的Ana-1細(xì)胞，以105個/mL細(xì)胞濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 100 μL，置于 CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%），培養(yǎng)24 h后，實驗組每孔添加含有PEs不同質(zhì)量濃度的完全培養(yǎng)基100 μL，使每孔的終質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL，空白對照組每孔添加等體積的完全培養(yǎng)基，每組處理設(shè)置6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，培養(yǎng)結(jié)束。取出培養(yǎng)板棄掉上清液，每孔分別加入DMSO 150 μL，振蕩 10 min，使沉淀溶解，在酶標(biāo)儀 490 nm處檢測各孔吸光度值，并計算細(xì)胞存活率，見公式（1）：

其中，A1為試驗組吸光度值，A0為對照組吸光度值。

1.2.4 PE對細(xì)胞因子分泌量的影響 以105個/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%），培養(yǎng) 24 h后，實驗組每孔添加含有PEs不同質(zhì)量濃度的完全培養(yǎng)基100 μL， 使每孔終質(zhì)量濃度分別為 6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，空白對照組每孔添加等體積的完全培養(yǎng)基，每組處理設(shè)置6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱孵育24 h后，培養(yǎng)結(jié)束，分別收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min，按Elisa試劑盒上說明進(jìn)行細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量的檢測。

1.2.5 不同作用時間PEM對細(xì)胞因子分泌量的影響 以105個/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μL，置于 CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%），培養(yǎng)24 h后，實驗組每孔添加含有PEM的完全培養(yǎng)基 100 μL，使其終質(zhì)量濃度為 12.5 μg/mL，于 0、4、8、12、16、20、24 h 收集 6 個復(fù)孔細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min，分別吸取培養(yǎng)液上清液，按Elisa試劑盒上說明進(jìn)行細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量檢測的操作。

1.2.6 PEM對細(xì)胞吞噬活性的影響 參考張祺[16]的方法，并稍做修改，以105個/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%），培養(yǎng)24 h后，實驗組每孔添加含有PEM不同質(zhì)量濃度的完全培養(yǎng)基100 μL，使每孔終質(zhì)量濃度分別為 6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，空白對照組每孔添加等體積的完全培養(yǎng)基，每組處理設(shè)置6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱孵育24 h后培養(yǎng)結(jié)束，棄去細(xì)胞上清液，每孔加入200 μL 0.1 g/L中性紅溶液，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%）培養(yǎng)1 h后，吸棄細(xì)胞上清液，每孔加200 μL預(yù)溫的PBS清洗細(xì)胞，重復(fù)操作3次，加入200 μL 0.1mol/L乙酸-乙醇（體積比1∶1）溶解細(xì)胞，酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光值。

1.2.7 PEM對膜表面蛋白表達(dá)量的影響 細(xì)胞布板情況及培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)結(jié)束，分別收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融，高速離心10 min，得到細(xì)胞裂解液，按Elisa試劑盒上說明進(jìn)行膜表面蛋白TLR2、TLR4含量的檢測。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 8.0繪圖及線性回歸分析，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，MTT法測量細(xì)胞存活率結(jié)果采用方差檢驗，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，細(xì)胞因子數(shù)值分析采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。當(dāng)P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度PEs對Ana-1存活率的影響

PEs對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1存活率的影響各有不同，如表1所示，LPS為陽性對照。結(jié)果表明：PEM、PEE、PEC均表現(xiàn)出了較好的促進(jìn)Ana-1細(xì)胞增殖的作用，而PEP則沒有表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)Ana-1細(xì)胞增殖的作用。其中，PEM對Ana-1細(xì)胞的刺激增殖作用最強(qiáng)，但不呈現(xiàn)濃度依賴性，在質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL時有最強(qiáng)的促進(jìn)增殖作用，Ana-1 細(xì)胞的存活率達(dá)到（127.83±6.82）%，高濃度時刺激作用不明顯。PEE和PEC也表現(xiàn)出了刺激Ana-1細(xì)胞增殖的作用，但較PEM組的刺激作用稍弱，這2種提取物均在質(zhì)量濃度為25 μg/mL時表現(xiàn)出最強(qiáng)的促進(jìn)增殖作用，Ana-1細(xì)胞的存活率分別為（114.93±4.29）%和（110.05±3.78）%，不呈現(xiàn)濃度依賴性，且高濃度時刺激作用均不明顯。

表1 不同質(zhì)量濃度PEs對Ana-1細(xì)胞存活率的影響（以±s表示）Table 1 Effect of various concertrations of Pleurotus eryngii extracts on Ana-1 cell survival rate（±s）

表1 不同質(zhì)量濃度PEs對Ana-1細(xì)胞存活率的影響（以±s表示）Table 1 Effect of various concertrations of Pleurotus eryngii extracts on Ana-1 cell survival rate（±s）

注：每列中相同字母代表無顯著性差異，不同字母代表有顯著性差異，P＜0.05。

不同質(zhì)量濃度P E s作用于A n a-1細(xì)胞的存活率/%6 μ g/m L 0 μ g/m L 1 2.5 μ g/m L 5 0 μ g/m L 1 0 0 μ g/m L P E P 2 5 μ g/m L 1 0 0.0 0 9 8.6 1±3.1 3 a 1 0 3.4 6±6.3 5 a 9 4.6 2±4.1 5 a 9 5.5 3±7.4 3 a 1 0 4.2 3±5.3 2 b 1 0 0.0 0 1 0 8.5 7±7.1 6 b 1 1 0.0 5±3.7 8 b 1 0 1.7 5±5.6 2 a 1 0 3.8 1±3.6 0 a 9 7.6 6±3.1 8 a P E E 1 0 0.0 0 1 1 4.9 3±4.2 9 c 1 0 3.3 6±2.7 8 b 1 0 4.1 8±7.1 8 a P E C 1 1 0.1 8±4.2 0 b 1 1 2.6 7±4.1 4 b 9 1.9 4±4.2 2 b 1 1 0.3 1±3.2 9 c 1 2 7.8 3±6.8 2 b 1 0 0.0 0 1 1 5.4 3±2.9 6 c 1 0 2.9 3±3.3 9 a 1 0 8.0 6±3.1 2 b 9 6.4 3±3.8 1 a L P S(陽性對照)1 0 1.0 5±5.7 8 a 1 1 4.6 2±5.1 2 d P E M 1 0 0.0 0 2 0 0 μ g/m L 1 2 0.6 7±3.9 1 b 1 3 9.7 2±5.0 8 d 1 1 0.3 5±5.3 3 b 1 0 1.2 2±7.1 1 a 9 5.7 4±2.5 0 a 8 6.8 2±6.1 2 c

2.2 不同質(zhì)量濃度PEs對Ana-1分泌細(xì)胞因子TNF-α的影響

不同質(zhì)量濃度PEs作用于Ana-1細(xì)胞后，細(xì)胞因子TNF-α分泌的變化情況如圖1，LPS為陽性對照。由圖中可知，Ana-1細(xì)胞接受4種提取物作用后，細(xì)胞因子TNF-α分泌的變化均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，沒有濃度依賴性，PEM組的TNF-α分泌量上升趨勢最大，其次為PEE、PEC、PEP的變化趨勢比較平緩。其中，當(dāng)PEM質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL時，Ana-1出現(xiàn)了TNF-α的分泌高峰，細(xì)胞上清液中的TNF-α質(zhì)量濃度達(dá)到64.16 ng/mL，而在PEE、PEC質(zhì)量濃度分別為25 μg/mL時，細(xì)胞上清液中的TNF-α質(zhì)量濃度分別為61.20 ng/L和60.31 ng/L，均低于PEM組。

圖1 不同質(zhì)量濃度PEs對TNF-α分泌的影響Fig.1 Effect of various concentrations of Pleurotus eryngii extracts on TNF-α secretion

2.3 不同質(zhì)量濃度PEs對Ana-1分泌細(xì)胞因子IL-6的影響

不同質(zhì)量濃度PEs作用于Ana-1細(xì)胞后，細(xì)胞因子IL-6分泌的變化情況如圖2，LPS為陽性對照。由圖中可知，Ana-1細(xì)胞接受4種提取物作用后，細(xì)胞因子IL-6分泌的變化均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，PEM組的IL-6分泌量上升趨勢最大，其次為PEC，而PEE、PEP的變化趨勢比較平緩。其中，當(dāng) PEM、PEC 質(zhì)量濃度為 12.5 μg/mL時，Ana-1出現(xiàn)了IL-6的分泌高峰，細(xì)胞上清液中的IL-6質(zhì)量濃度分別達(dá)到了23.72 ng/L和20.70 ng/L，而在PEE、PEP質(zhì)量濃度分別為25 μg/mL時，細(xì)胞上清液中的IL-6質(zhì)量濃度分別為19.82 ng/L和19.61 ng/L，均低于PEM組。

圖2 不同質(zhì)量濃度PEs對IL-6分泌的影響Fig.2 Effect of various concentrations of Pleurotus eryngii extracts on IL-6 secretion

2.4 PEM組Ana-1細(xì)胞活性與細(xì)胞因子分泌量的相關(guān)性分析

由表1、圖3及圖4可以看出，PEM作用于Ana-1細(xì)胞后表現(xiàn)出了最高的增殖活性及其細(xì)胞因子的分泌高峰，經(jīng)SPSS軟件分析，TNF-α分泌量和IL-6分泌量與PEM作用的細(xì)胞存活率成顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù) r分別為 0.926和 0.986）（見表 2），這說明PEM的刺激作用與Ana-1細(xì)胞活性、細(xì)胞因子的分泌存在著密切聯(lián)系，適量質(zhì)量濃度的PEM能有效促進(jìn)Ana-1細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子的釋放。

表2 PEM組細(xì)胞存活率與TNF-α、IL-6分泌量相關(guān)性Table 2 Correlations between the cell survival rate，TNF-α and IL-6 secretion by stimulating with Pleurotus eryngii mathanol extracts

2.5 不同作用時間PEM對細(xì)胞因子分泌的影響

PEM （質(zhì)量濃度為 12.5 μg/mL，在此條件下Ana-1細(xì)胞表現(xiàn)出最高的增殖活性）作用于細(xì)胞后2種細(xì)胞因子的分泌隨時間變化情況如圖3所示。由圖 3（a）可知，Ana-1細(xì)胞在加入 PEM 后 TNF-α分泌量顯著升高，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在作用12 h時出現(xiàn)TNF-α分泌高峰，達(dá)到67.03 ng/L。隨著時間的延長，TNF-α分泌量稍有下降，但均顯著高于細(xì)胞未接受PEM作用時TNF-α的分泌量。Ana-1細(xì)胞在加入PEM后IL-6分泌量變化情況如圖3（b），其分泌量也顯著升高，但升高趨勢與TNF-α的變化不同，IL-6分泌量的變化是呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。在作用24 h時出現(xiàn)分泌高峰，細(xì)胞上清液中IL-6質(zhì)量濃度達(dá)到23.70 ng/L。

圖3 不同作用時間PEM對細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌的影響Fig.3 Effect of Pleurotus eryngii methanol extracts on TNF-α and IL-6 secretion by stimulating with different treament time

2.6 不同質(zhì)量濃度PEM對細(xì)胞吞噬活性的影響

不同質(zhì)量濃度PEM作用于Ana-1細(xì)胞，通過中性紅吞噬實驗檢測細(xì)胞的吞噬能力變化，如圖4。結(jié)果顯示：PEM作用于Ana-1細(xì)胞后吞噬活性的變化均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，質(zhì)量濃度為12.5～100 μg/mL PEM的4個處理組吞噬中性紅能力相比空白組均明顯升高，其中，PEM質(zhì)量濃度為25 μg/mL時細(xì)胞表現(xiàn)出最高的吞噬活性。

圖4 不同質(zhì)量濃度PEs對細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.4 Effect of various concentrations of Pleurotus eryngii extracts on macrophage cell phagocytosis activity

2.7 不同質(zhì)量濃度PEM對細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的影響

不同質(zhì)量濃度PEM作用于Ana-1細(xì)胞后，細(xì)胞膜蛋白Toll樣受體TLR2和TLR4表達(dá)量的變化情況如圖5。由圖5（a）可知，Ana-1細(xì)胞在加入PEM后TLR2的表達(dá)量顯著升高，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，PEM質(zhì)量濃度為25 μg/mL時TLR2表達(dá)量最高，達(dá)到4.36 ng/mL。隨著質(zhì)量濃度的升高，TLR2表達(dá)量稍有下降，但均顯著高于空白組TLR2的表達(dá)量。Ana-1細(xì)胞在加入PEM后TLR4表達(dá)量變化情況如圖5（b），其表達(dá)量也顯著升高，但升高趨勢與TLR2的變化不同，PEM質(zhì)量濃度在25～100 μg/mL范圍內(nèi)，TLR4表達(dá)量顯著高于空白組，質(zhì)量濃度為50 μg/mL時表達(dá)量最高，達(dá)到5.78 ng/mL。

圖5PEM對TLR2和TLR4表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Pleurotus eryngii methanol extracts on TLR2 and TLR4 expression

3 討 論

已有研究表明，杏鮑菇水溶性多糖能夠通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖、提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力來達(dá)到抗癌效果[17]，而對于杏鮑菇脂溶性成分的免疫活性研究則相對較少。眾所周知，巨噬細(xì)胞在機(jī)體固有免疫與適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著復(fù)雜的功能，尤其在對抗感染和損傷的宿主防御中起到重要作用[18]。增殖是免疫細(xì)胞分化成多種功能形態(tài)、并在免疫應(yīng)答中發(fā)揮相應(yīng)作用的前提和基礎(chǔ)，巨噬細(xì)胞的增殖對于其各種免疫應(yīng)答功能的實現(xiàn)是必需的[19]。本研究中以杏鮑菇為原料，利用不同極性溶劑對其中的活性成分進(jìn)行萃取，并將各提取物作用于小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1，在比較各提取物對Ana-1細(xì)胞存活率的影響后發(fā)現(xiàn)：4種提取物對該細(xì)胞不僅沒有細(xì)胞毒性，還有不同程度的促進(jìn)增殖的作用，其中，PEM促進(jìn)增殖的效果最為顯著，在其質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL時有最強(qiáng)的促進(jìn)增殖作用，Ana-1細(xì)胞的存活率達(dá)到（127.83±6.82）%。

巨噬細(xì)胞來源于骨髓干細(xì)胞，是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細(xì)胞類型，由血液中單核細(xì)胞遷入組織后分化而成[20]。它在執(zhí)行免疫應(yīng)答或免疫監(jiān)視功能的過程中，主要有2個方面的作用：1是通過吞噬作用或者細(xì)胞毒性作用，2是抗原遞呈作用[21]。巨噬細(xì)胞可以分泌的各種免疫活性分子，如TNF-α、IL-6、IL-10等，均具有腫瘤細(xì)胞和病原菌的直接毒性[22]。巨噬細(xì)胞除免疫作用外，還有吞噬作用。巨噬細(xì)胞將各類病原微生物、機(jī)體衰老死亡的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等大顆粒抗原攝入胞內(nèi)，形成吞噬溶酶體，在多種酶的作用下，殺滅和消化抗原性異物[23]。 本研究中，Ana-1 細(xì)胞在 PEM 12.5 μg/mL 質(zhì)量濃度的刺激作用下，TNF-α和IL-6 2種細(xì)胞因子均出現(xiàn)了分泌高峰；此外，在中性紅吞噬活性試驗結(jié)果顯示，12.5 μg/mL PEM能明顯增強(qiáng)Ana-1的吞噬活性。因此，適量PEM能起到激活巨噬細(xì)胞，提高其免疫活性的作用。

在巨噬細(xì)胞分泌的諸多細(xì)胞因子中，TNF-α備受關(guān)注，越來越多的研究表明，其體內(nèi)水平的高低與疾病嚴(yán)重程度直接相關(guān)[24]。在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中，TNF-α作為早期促炎因子，具有激活中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的作用，可以刺激誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的釋放[25]。IL-6是多功能炎性細(xì)胞因子，具有致炎和抗炎的雙向功能，不僅可以活化B細(xì)胞，促使其分泌抗體，也可以抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和TNF-α而起到細(xì)胞保護(hù)和抗炎作用[26]。本研究中，在PEM 12.5 μg/mL的質(zhì)量濃度刺激作用下，通過檢測不同時間對TNF-α和IL-6分泌量影響的結(jié)果顯示：TNF-α分泌量先升高后下降，在刺激12 h后出現(xiàn)分泌高峰，而IL-6分泌量緩慢上升，在刺激24 h后出現(xiàn)分泌高峰，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于TNF-α誘導(dǎo)IL-6分泌，而IL-6抑制TNF-α過量分泌，從而達(dá)到細(xì)胞因子之間誘導(dǎo)和拮抗作用的平衡狀態(tài)。

Toll樣受體（Toll-1ike receptors，TLRs）是巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞表面識別多種病原體及內(nèi)源性物質(zhì)的跨膜蛋白[27]，TLRs可以通過各自不同的配基識別相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），激活一系列的信號通路啟動宿主抵抗病原微生物的天然免疫，并對特異性免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)控[28]。巨噬細(xì)胞在接受外界刺激后，通過TLRs產(chǎn)生激活信號，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進(jìn)而激活一系列免疫反應(yīng)，如增強(qiáng)吞噬活性、分泌細(xì)胞因子等[29]。本研究通過觀察PEM作用于巨噬細(xì)胞后對TLR2、TLR4 2種膜蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示：PEM能夠顯著上調(diào)TLR2、TLR4的表達(dá)量，這說明巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答中的NF-κB通路能夠被PEM激活，而在本研究中的觀察到的Ana-1細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌量升高、吞噬活性增加等現(xiàn)象可能與NF-κB通路的激活有關(guān)。曾有文獻(xiàn)報道，杏鮑菇醇提取物在小鼠肥大細(xì)胞的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中有重要作用，并推測其活性物質(zhì)為麥角甾醇或其過氧化物[29]，本研究中表現(xiàn)出免疫活性的成分可能和其相近，但仍需做進(jìn)一步詳細(xì)研究。此外，本研究在探討PEM免疫調(diào)節(jié)的可能機(jī)制時，僅對其細(xì)胞表面介導(dǎo)受體蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測，進(jìn)一步的調(diào)節(jié)機(jī)制尚需對其相關(guān)信號通路控制基因的影響進(jìn)行探討。

4 結(jié) 語

本文作者利用PEs對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1進(jìn)行了免疫活性研究，結(jié)果顯示：PEs對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1有不同程度上的免疫刺激作用，PEM表現(xiàn)出了最強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的活性，在PEM質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL的條件下，能夠促進(jìn)Ana-1細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，細(xì)胞因子TNF-α和IL-6均出現(xiàn)分泌高峰；但PEM對細(xì)胞因子分泌的作用時間不同，PEM作用于Ana-1細(xì)胞后，在12 h時出現(xiàn)TNF-α分泌高峰，而IL-6在24 h時出現(xiàn)分泌高峰。此外，PEM可以激活A(yù)na-1，提高細(xì)胞吞噬活性，促進(jìn)細(xì)胞表面膜蛋白受體TLR2、TLR4的表達(dá)。本研究結(jié)果表明了PEM能夠通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌和提高吞噬活性的方式實現(xiàn)免疫增強(qiáng)功能，對杏鮑菇功能性食品或相關(guān)藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

[1]CHEN Junchen，YANG Yilong，WENG Minjie，et al.Optimization of combined hot-air and vacuum drying technology for instant Pleurotus eeryngii[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2014，30（14）：331-338.（in Chinese）

[2]TIAN Pingping，WANG Jie，QIN Xiaoyi，et al.Effect of postharvest treatment on the storage quality and antioxidant enzyme system of Pleurotus eryngii[J].Scientia Agricultura Sinica，2015，48（5）：941-951.（in Chinese）

[3]KUNIYOSHI S，MAIKO Y，MAYUMI G，et al.Estrogen-like activity and prevention effect of bone loss in calcium deficient ovariectomized rats by the extract of Pleurotus eryngii[J].Phytotherapy Research，2006，20（8）：659-664.

[4]ASADUZZAMAN K，MOUSUMI T.Nutritional and medicinal importance of pleurotus mushrooms：An overview[J].Food Reviews International，2012，28（3）：313-329.

[5]MORI K，KOBAYASHI C，TOMITA T，et al.Antiatherosclerotic effect of the edible mushrooms Pleurotus eryngii（Eringi），Grifola frondosa （Maitake），and Hypsizygus marmoreus （Bunashimeji） in apolipoprotein E-deficient mice[J].Nutrtional Research，2008，28（5）：335-342.

[6]KIM J I，KANG M J，IM J，et al.Effect of king oyster mushroom （Pleurotus eryngii） on insulin resistance and dyslipidemia in db/db mice[J].Food Science Biotechnology，2010，19（1）：239-242.

[7]MAJTAN J.Pleuran：an effective nutritional supplement against upper respiratory tract infections[J].Nutritional Interventions and Athlete's Health，2013，59：57-61.

[8]WASSER S P，WEIS A L.Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms：current perspectives（review）[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，1999，1（1）：31-62.

[9]WANG H，NG T B.Pleureryn，a novel protease from fresh fruiting bodies of the edible mushroom Pleurotus eryngii[J].Biochemical And Biophysical Research Communications，2001，28（9）：750-755.

[10]WANG H，NG T B.Eryngin，a novel antifungal peptide from fruiting bodies of the edible mushroom Pleurotus eryngii[J].Peptides，2004，25（1）：1-5.

[11]WANG H，NG T B.Purification of a laccase from fruiting bodies of the mushroom Pleurotus eryngii[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2006，69（5）：521-525.

[12]MITSUAKI S，KYOJI Y，TSUNETOMO M，et al.Inhibitory effects of edible higher basidiomycetes mushroom extracts on mouse type IV allergy[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2002，4（1）：5-11.

[13]KIM S W，KIM H G，LEE B E，et al.Effects of mushroom Pleurotus eryngii extracts on bone metabolism[J].Clinical Nutrition，2006，25（1）：166-170.

[14]BAE J S，PARK J W，PARK S H，et al.Apoptotic cell death of human leukaemia U937 cells by ubiquinone-9 purified from Pleurotus eryngii[J].Natural Product Research，2009，23（12）：1112-1119.

[15]谷鴻喜，張鳳民，凌虹.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2012：139-140.

[16]ZHANG Qi，LI Xuemin，LI Zhaojie.Immunomodulatory effects of sea cucumber fucoidan on macrophage and the signaling pathways[J].Chinese Pharmacological Bulletin，2015，31（1）：87-92.（in Chinese）

[17]YANG Z，XU J，F(xiàn)U Q，et al.Antitumor activity of a polysaccharide from Pleurotus eryngii on mice bearing renal cancer[J].Carbohydrate Polymers，2013，95（2）：615-620.

[18]LIU Jing，ZHANG Wei，YANG Feng.Effects of sophoridine pretreating on the expression of c-jun in macrophage RAW264.7 induced by LPS[J].Journal of Ningxia Medical University，2010，32（2）：161-165.（in Chinese）

[19]JIA Wei，F(xiàn)AN Hua.Effect of active polysaccharide fraction from agaricus blazei murill on mouse macrophages[J].Food Science，2011，32（11）：277-280.（in Chinese）

[20]ZHAO L，DONG Y，CHEN Q et al.Extraction，purification，characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum[J].Carbohydrate Polymers，2010，80（3）：783-789.

[21]REN Yan，ZENG Yanling，LI Pan，et al.Experimental study of Tripterygium wilfordii Hook.f.for inhibiting TNF-α secretion in peritoneal macrophage of endometriosis patients and relevant cell model[J].Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，2012，21（7）：702-705.（in Chinese）

[22]WANG Song，WANG Wei，LUO Meng，et al.Regulating effect of compound glycyrrhizin on LPS-induced inflammatory factor release from murine RAW 264.7 cells[J].Progress in Pharmaceutical Sciences，2012，36（10）：465-470.（in Chinese）

[23]HUO Desheng，LIU Zhonghui，WANG Shiyao.Activin a enhances phagocytosis of murine macrophage cell line RAW264.7[J].Chinese Journal of Biologicals，2008，21（9）：759-763.（in Chinese）

[24]ZHANG M，CUI S W，CHEUNG P C K，et al.Antitumor polysaccharides from mushrooms：a review on their isolation process，structural characteristics and antitumor activity[J].Trends in Food Science and Technology，2007，18（1）：4-19.

[25]YUEN J W M，GOHEL M D I.Anticancer effects of Ganoderma lucidum：a review of scientific evidence[J].Nutrition and Cancer，2005，53（1）：11-17.

[26]LIN Liyan，ZHANG Huiyun，HE Shaohen.Advance in the research of correlation of IL-6 and its receptors with inflammation disease[J].China Tropical Medicine，2008，8（4）：680-682.（in Chinese）

[27]ZENG Xing，LIAN Hui，OU Run-Mei，et al.Effect of injectionwith PPS and BCG on expression of TLRs in mouse peritioneal macropllages[J].Chinese Journal of Immunology，2008，24（9）：341-346.（in Chinese）

[28]NOVAK M，VETVICKA V.Beta-glucans，history，and the present：immunomodulatory aspects and mechanisms of action[J].Journal of Immunotoxicology，2008，5（1）：47-57.

[29]HAN E H，HWANG Y P，KIM H G.Inhibitory effect of Pleurotus eryngii extracts on the activities of allergic mediators in antigen-stimulated mast cells[J].Food and Chemical Toxicology，2011，49（6）：1416-1425.