松茸口服液的功能特性

佟立君， 么宏偉， 付婷婷*， 謝晨陽， 吳洪軍，趙鳳臣， 韓書昌， 張學義， 馮 磊

（1.黑龍江省林業(yè)科學院，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江省林副特產研究所 黑龍江省非木質林產品研發(fā)重點實驗室，黑龍江 牡丹江157011）

松茸[Tricholoma matsutake（S.Ito et Imai） Sing]，俗稱松口蘑，是一種在溫帶和寒溫帶的松林與櫟林共同生長的共生菌[1]。健康的野生松茸子實體對生長環(huán)境要求苛刻，需要依賴柏樹、橡樹等闊葉林為其生長發(fā)育提供營養(yǎng)支持[2-3]。松茸含有多種氨基酸、維生素和脂肪及豐富的膳食纖維和活性酶，另含有雙鏈松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸有提高免疫力、抗氧化、抗衰老養(yǎng)顏、抗癌抗腫瘤、心血管疾病及治療糖尿病和促腸胃保肝臟等多種功效[6-8]。本課題以新鮮松茸為原料，利用超聲波輔助水提、弱堿鹽溶液提取和醇溶液提取3步提取法提取松茸中的營養(yǎng)物質，并制備成了松茸濃縮口服液。對其免疫調節(jié)能力、抗氧化能力和抗疲勞能力進行了功能性驗證。為日后松茸濃縮口服液的推廣或進一步研究奠定了理論數據基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

松茸濃縮口服液為實驗室自制，其制作過程先是利用超聲波輔助水提（提取條件：超聲功率125 W，超聲時間10 s，工作時間4 s，間隔時間1 s，得到含有水溶性多糖、維生素C、黃酮的提取物）、弱堿鹽溶液提?。ㄌ崛l件：碳酸氫鈉質量分數0.3%，氯化鈉質量分數0.5%，提取時間120 min，提取溫度80℃，得到堿溶性蛋白質）和醇溶液提?。ㄌ崛l件：乙醇體積分數80%，提取時間30 min，提取溫度70℃，得到含有多酚、三萜的提取物）。3步提取松茸中的營養(yǎng)物質，提取后濾液按1∶1混合然后過100目篩子過濾。在50℃、60 r/min對上述混合溶液進行蒸餾濃縮，蒸餾濃縮至原混合溶液體積的1/10，混合濃縮得到的產品為無渾濁和沉淀的液體，味甘，相對密度為（1.10±0.05） g/mL，pH 值為（7.50±0.05），每支裝量為10 mL，棕色瓶包裝，衛(wèi)生學檢測符合標準，具體營養(yǎng)成分見表1和表2。

表1 松茸口服液各成分質量濃度Table 1 Allingredientscontent of Tricholoma matsutakeoral liquid

表2 松茸口服液氨基酸質量濃度Table 2 Amino acid content of Tricholoma matsutake oral liquid

續(xù)表2

1.2 試驗試劑

血清IgG試劑盒、印度墨汁、丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、血乳酸試劑盒、血清尿素試劑盒，均購于南京建成公司。

1.3 試驗動物

昆明小鼠（Mus musculus） 雌性，SPF 級，6～8 周齡，體質量（18±2）g，購于中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF級動物中心，小鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房。小鼠飼養(yǎng)于標準條件下（濕度（50%±10%）；12 h白晝/12 h黑夜交替），飼喂經過滅菌的鼠糧及蒸餾水。

1.4 試驗儀器與設備

主要試驗儀器與設備見表3。

表3 主要試驗儀器Table 3 Main laboratory apparatus

1.5 試驗方法

1.5.1 試驗小鼠分組及處理

48只小鼠經 3天適應性飼養(yǎng)后，平均分為4組，每組12只。每天早晚各添飼料一次，所有小鼠可以自由接觸到飼料和水。每次試驗開始、結束時都需稱體重。2組小鼠灌胃無菌生理鹽水，另外2組灌胃松茸濃縮口服液，每只小鼠每天灌胃一次，每次 0.02 mL/g，連續(xù) 21 d。

1.5.2 免疫調節(jié)能力指標的測定

1）胸腺指數、脾指數測定 分別于試驗的第7、14 d和21 d摘眼球放血脫頸椎法處死小鼠，剝掉胸腺（脾），并將其周圍組織剝離干凈，稱重[9]。

式（1）中：I為胸腺（脾）指數；m1為胸腺（脾）重量，mg；m0為體質量，g。

2）血清IgG質量濃度 分別于試驗的第7、14和21 d摘眼球放血脫頸椎法處死小鼠，按照IgG試劑盒說明書操作。

3）巨噬細胞吞噬功能

①將印度墨汁按1∶3比例稀釋，于試驗的第7、14 d和21 d按小白鼠每10 g體質量需0.1 mL稀釋墨汁計算，經鼠尾靜脈注入體內，待注射完畢立即計時。

②注入稀釋墨汁后2、10 min時，分別從眼眶后靜脈叢取血20 μL，于2 mL Ca2CO3溶液中搖勻，用紫外分光光度計在600 nm波長下測OD值，以Ca2CO3溶液為空白對照。

根據公式計算碳顆粒廓清指數（CICP）和校正廓清指數（ACICP）。

式（2）中 OD1，OD2分別為，時取血樣測得的吸光度值；t1，t2分別為 2 min 和 10 min。

1.5.3 抗氧化活性指標的測定

1）丙二醛濃度測定 分別于試驗的第7、14 d和21 d摘眼球放血脫頸椎法處死小鼠，按照MDA試劑盒說明書操作。

按以下公式（4）計算血清MDA濃度（nmol/mL）：

2）超氧化物歧化酶活性測定 分別于試驗的第7、14 d和21 d摘眼球放血處死小鼠，按照SOD試劑盒說明書操作。

①按公式（5）計算SOD的抑制率：

②按公式（6）計算SOD的活力：

1.5.4 抗疲勞功能指標的測定

1）力竭游泳時間測定 每天灌胃1次，分別連續(xù)灌胃7、14 d和21 d。末次灌胃30 min后，在鼠尾根部系上質量分數5%體質量鉛絲置于游泳箱中游泳。水深高于30 cm，水溫（25±1.0）℃。參照力竭判斷標準（即小鼠頭部沉入水中，經10 s還不能返回水面視為力竭），記錄自游泳開始至力竭的時間，作為游泳時間。數據以均數和標準差（x±SD）表示。

2）血乳酸濃度測定 分別于灌胃后第7、14 d和21 d，將試驗組與對照組小鼠尾部負質量分數5%體質量的鉛絲放入30℃的游泳箱中游泳 10 min；游泳后即刻取小鼠內眥靜脈血20 μL，按照血乳酸含量試劑盒說明書操作。

3）血清尿素氮濃度測定 分別于灌胃后第7、14 d和21 d，將試驗組與對照組小鼠同時放入 30℃的游泳箱中游泳60 min，即刻取小鼠眼靜脈叢血，離心，取血清，按照血清尿素氮含量試劑盒說明書操作。

計算公式如式（7）：

4）統計學方法 實驗所得數據以（x±SD）表示，應用T-Test檢驗處理，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示差異極其顯著。

2 結果與分析

2.1 松茸濃縮口服液對小鼠免疫調節(jié)力的影響

2.1.1 對胸腺指數的影響 胸腺內的巴細胞對 T淋巴細胞的成熟和細胞介導的免疫的發(fā)展有重大參與作用。通過試驗可以初步認為松茸濃縮口服液能夠促進小鼠胸腺的發(fā)育，結果如表4。

表4 松茸濃縮口服液對小鼠胸腺指數影響Table 4 Matsutake concentrated oral liquid on thymus index

從表4中可以看出，隨著時間的增加，各組胸腺指數呈上升趨勢，其中試驗組胸腺指數均高于對照組。在灌胃松茸濃縮口服液7、14 d后，試驗組胸腺指數高于對照組，分別提高了12%和16%，但是差異不顯著。21 d后，試驗組的胸腺指數明顯高于對照組，提高了 26%，且差異顯著（P＜0.05）。

2.1.2 對脾臟指數的影響 單核吞噬細胞系統主要由脾臟內吞噬細胞組成。脾臟主要的免疫學功能是通過截流血液里的微生物并與之產生免疫應答來過濾血液。試驗發(fā)現松茸濃縮口服液可以促進小鼠脾臟的發(fā)育。結果如表5。

表5 松茸濃縮口服液對小鼠脾臟指數影響Table 5 Matsutake concentrated oral liquid on the spleen index

從表5中可以看出小鼠脾臟指數逐漸增加，且試驗組均高于對照組，7、14 d和21 d脾臟指數分別提高了6.4%、7.3%和9.1%，21 d時試驗組與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。說明小鼠受到松茸濃縮口服液的作用后，促進了脾臟的發(fā)育。

2.1.3 對血清IgG質量濃度的影響 血清中 IgG是體液免疫活性細胞產生的體液免疫分子，其含量是體液免疫系統功能狀態(tài)的重要指標。試驗表明灌胃松茸濃縮口服液的小鼠血清IgG質量濃度較對照組有增加的趨勢，說明松茸濃縮口服液有增加血清中 IgG質量濃度的作用，如表6。

表6 松茸濃縮口服液對小鼠血清IgG質量濃度影響Table 6 Matsutake oral concentrate on serum IgG levels in mice

從表6中不難看出，灌胃口服液7 d后，試驗組IgG質量濃度與對照組變化不大，沒有顯著差異，而灌胃14 d及21 d后，小鼠血清IgG質量濃度分別提高了10%和11%，差異極其顯著（P＜0.01）。

2.1.4 對巨噬細胞吞噬功能的影響 巨噬細胞可迅速吞噬由靜脈注入的特定大小的惰性碳粒，而從血流中廓清。因此可通過測定血清中碳粒的消失速度來反映巨噬細胞吞噬的能力。經過試驗后發(fā)現，松茸濃縮口服液有提高巨噬細胞的吞噬功能的效果，如表7。

表7 松茸濃縮口服液對小鼠巨噬細胞吞噬指數影響Table 7 Tricholoma matsutake concentrated liquid impact on macrophage phagocytosis of mice

從表7中可以發(fā)現，在灌胃松茸濃縮口服液7 d及14 d后，試驗組與對照組相比較，吞噬能力分別提高了28%、32%，但沒有顯著差異。灌胃21 d后，試驗組遠高于對照組，提高了51%，差異性顯著（P＜0.05）。

2.2 松茸濃縮口服液對小鼠抗氧化活性的影響

2.2.1 對丙二醛濃度的影響 MDA是一種動物體內多不飽和脂質氧化的終產物，其濃度可以反映體內不飽和脂質的過氧化程度，間接地反映細胞膜的損傷程度。松茸濃縮口服液對小鼠體內MDA濃度的影響見表8。

表8 松茸濃縮口服液對小鼠MDA濃度影響Table 8 Tricholoma matsutake concentrated liquid impacton MDA content in mice

由表8可知，試驗組MDA濃度均低于空白組，在第7 d和14 d時，MDA濃度分別下降了10%和16%，在灌胃21 d后對照組與試驗組相比，降低了57%，差異性極其顯著（P＜0.01）。說明松茸濃縮口服液可以降低小鼠血清MDA濃度，從而減輕小鼠體內膜脂質氧化。

2.2.2 對超氧化物歧化酶活力的影響 生物體內的SOD是一種重要的自由基清除劑，其具有維持活性氧代謝平衡，保護膜結構的功能。SOD能夠清除體內的超氧陰離子自由基。故其活力可反映機體清除自由基能力。本試驗測定了血清中SOD活力，結果見表9。

表9 松茸濃縮口服液對小鼠SOD活力影響Table 9 Tricholoma matsutake concentrated liquid impact on SOD content in mice

從表9中可以看出，試驗組中小鼠血清的SOD活力均高于空白組，但是在灌胃7 d及14 d時并無顯著性差異，分別提高了7%和6%。在灌胃21 d后，試驗組小鼠血清內的SOD活力則明顯高于對照組，提高了11%，差異顯著（P＜0.05）。說明試驗組的松茸濃縮口服液可以清除小鼠體內過量的O2-，提高小鼠血清的抗氧化能力。

2.3 松茸濃縮口服液對小鼠抗疲勞功能的影響

2.3.1 對小鼠力竭游泳時間的影響 力竭時間是反映運動能力的常用指標，力竭時間的增長是機體抗疲勞能力提升最有力的宏觀體現。長時間的劇烈運動，機體會相對缺氧從而導致糖酵解作用加快，進而產生大量的乳酸，乳酸積累過多會影響體內環(huán)境的相對穩(wěn)定和體內的正常代謝過程。

表10 松茸濃縮口服液對小鼠負重游泳時間影響Table 10 Matsutake concentrated liquid impact on weightloading swimming time in mice

由表10可見，灌胃松茸濃縮口服液7、14 d和21 d后，試驗組與空白對照組比較，游泳時間有所延長，分別提高了43%、41%和39%，但無顯著性差異，可以初步認為松茸濃縮口服液能延長小鼠負重游泳時間，但機制其還需進一步試驗驗證。

2.3.2 對小鼠血乳酸濃度的影響 乳酸是無氧糖酵解的產物，經過短時間大強度劇烈運動后，乳酸含量迅速增加。所以短時劇烈運動后血乳酸降低的幅度能反映出機體疲勞消除速度、機體恢復程度。

表11 松茸濃縮口服液對血乳酸濃度影響Table 11 Tricholoma matsutake concentrated liquid impact on blood lactic acid content

從表11中可以發(fā)現，在灌胃松茸濃縮口服液7 d后，試驗組與對照組無明顯變化。14 d與21 d后，試驗組小鼠血清中血乳酸濃度明顯低于對照組，分別降低了 21%和 29%，有顯著性差異（P＜0.05），隨著灌胃時間的增加，血清中血乳酸濃度呈明顯的下降趨勢。

2.3.3 對小鼠血清尿素氮濃度的影響 血清尿素含量的變化可反應體內含氮物質分解代謝狀況，較長時間以及激烈運動或者強體力勞動后會使血尿素含量增高。當打破能量平衡時，含氮物質的分解代謝加強，此時尿素量增加，機體尿素氮含量隨勞動或運動負荷成正比，其中機體對負荷適應能力越差，尿素氮增加就越明顯。血尿素含量對于機體在負荷時的反應是一個靈敏的指標，因此通過減少蛋白質的分解，降低血清尿素氮水平，可提高對運動負荷的適應能力。

從表12可以發(fā)現，在灌胃松茸濃縮口服液7 d后，對照組與試驗組血清中尿素氮濃度基本不變，14 d與21 d后，對照組與試驗組相比血清尿素氮濃度均明顯下降，分別下降了38%和49%，差異極其顯著（P＜0.01）。

表12 松茸濃縮口服液對血清尿素氮濃度影響Table 12 Tricholoma matsutake concentrated liquidimpact on serum urea nitrogen content

3 結 語

本試驗以小鼠的胸腺指數、脾臟指數、血清IgG質量濃度和巨噬細胞吞噬能力為檢測指標，研究了松茸濃縮口服液對小鼠免疫能力的影響。結果顯示，灌胃松茸濃縮口服液組小鼠與生理鹽水組小鼠比較，胸腺指數和脾臟指數呈上升趨勢，且當灌胃21 d時試驗組小鼠胸腺指數與脾臟指數均顯著上升（P＜0.05），表明松茸濃縮口服液能有效的促進小鼠胸腺與脾臟的發(fā)育。在研究小鼠血清中IgG質量濃度和巨噬細胞吞噬能力時發(fā)現，試驗組IgG質量濃度均高于對照組，在灌胃14 d及21 d時，差異極其顯著（P＜0.01）。而巨噬細胞吞噬能力則在灌胃后21 d產生顯著性差異（P＜0.05）?？梢猿醪秸f明，松茸濃縮口服液能顯著提高小鼠的免疫調節(jié)能力，與其他研究結果一致[10-12]。

研究發(fā)現，對照組與試驗組相比，試驗組小鼠血清中MDA濃度均低于對照組，且隨著灌胃時間的增加，MDA濃度顯著下降，在灌胃21 d后對照組與試驗組存在及其顯著性差異（P＜0.01）。這可能是因為松茸中的營養(yǎng)物質在生物體內直接參與猝滅自由基的途徑，并通過參與調動或激活機體的內源性抗氧化劑，使其數量增大和活性增強到機體需要的水平，從而避免或減輕自由基對機體的氧化損傷[13-15]。而試驗組中小鼠血清的SOD活力雖然高于對照組，但是在灌胃7 d和14 d時并無明顯差異，當灌胃21 d后，試驗組小鼠血清內的SOD活力才明顯高于對照組，存在明顯差異（P＜0.05）。這可能是由于松茸濃縮口服液雖然可以提高血清內SOD活力，但是提高SOD活力的能力與修復受損細胞并不能快速的完成，而需要較長時間的累積作用。綜上可知，通過較長時間灌胃松茸濃縮口服液，小鼠的抗氧化能力得到了顯著性的提高，這與其他研究結果相吻合[16]。

通過小鼠力竭游泳后發(fā)現，對照組與試驗組相比較，小鼠力竭游泳的時間雖然有提高，但是并沒有明顯的差異，這可能是由于試驗小鼠數量較少，灌胃時間短，個體間的差別不大造成的。而小鼠血清中血乳酸濃度與血清尿素氮濃度均有所下降，在灌胃松茸濃縮口服液14 d后，就開始有顯著 （P＜0.05）和極其顯著（P＜0.01）的差異。松茸中含有皂甙、多糖、黃酮、多種氨基及酸、硒、鋅、銅等多種微量元素[17-18]，其中皂苷可以提高肌糖原對運動所需的能量的儲存能力，也可增加LDH活性，加速乳酸代謝，防止乳酸在體內聚集[19]；體內主要的供能物質是糖類[20]，其供應不足時會通過蛋白質分解供能，進而血液中尿素氮含量增加，糖類供能充足與否的衡量標準是血清尿素氮濃度，血清尿素氮清除效率越高，運動產生的肌肉疲勞效應越不明顯；黃酮類物質，能降低蛋白質的分解速度，增強蛋白質的合成能力，以及促使胰島素水平升高[21]。正是由于松茸濃縮口服液中營養(yǎng)物質豐富，所以松茸濃縮口服液可以增強小鼠抗疲勞性并對小鼠疲勞有一定的緩解作用。

[1]BYEON S E，LEE J，LEE E，et al.Functional activation of macrophages，monocytes and splenic lymphocytes by polysaccharide fraction from Tricholoma matsutake[J].Archives of Pharmacal Research，2009，32（11）：1565-1572.

[2]DING X，TANG J，CAO M，et al.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Tricholoma matsutake[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（2）：271-275.

[3]KIM S S，LEE J S.Process development formycelial growth and polysaccharide production in Tricholoma matsutake liquidculture[J].Journalof Bioscienceand Bioengineering，2010，3：351-355.

[4]YIN X L，YOU Q H.Immunomodulatory activities of different solvent extracts from Tricholoma matsutake（S.Ito et S.Imai）singer（higherbasidiomycetes） on normal mice[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2012，14：547-554.

[5]YOU Q H，YIN X L.Pulsed counter-current ultrasound-assistedextraction and characterization of polysaccharides from Boletus edulis[J].Carbohydrate Polymers，2014，101：379-385.

[6]YOU Q H，YIN X L.Extraction purificationand antioxidant activities of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai[J].Carbohydrate Polymers，2014，99：1-10.

[7]YOUQH，YINXL.EnzymeassistedextractionofpolysaccharidesfromthefruitofCornusofficinalis[J].Carbohydrate Polymers，2013，98：607-610.

[8]LIU Peigui，YUAN Mingsheng，WANG Xianghua.Notes on the resources of matsutake group and their reasonable utilization as well as effective conservation in China[J].Journal of Natural Resources，1999，3：245-252.（in Chinese）

[9]胡澤開.貓爪草免疫活性部位的篩選和貓爪草多糖對小鼠免疫功能的影響[D].鄭州：河南中醫(yī)學院，2007.

[10]CHEN Xia，LIU Qin，DING Kan.Research on chemical component，activity and pharmacological action of Tricholoma matsutake[J].China Healthcare Frontiers，2009，12（4）：114-116.（in Chinese）

[11]HOSHI H，IIJIMA H，ISHIHARA Y，et al.Absorption and tissue distribution of an immunomodulatory alpha-D-glucan after oral administration of Tricholoma matsutake[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（17）：7715-7720.

[12]KIM J，BYEON S，LEE Y G，et al.Immunostimulatory activities ofpolysaccharides from liquid culture of pine-mushroom Tricholoma matsutake[J].Journal of Microbiol Biotechnol，2008，18（1）：95-103．

[13]LV Xiru，GUO Liang，CHANG Mingchang，et al.Antioxidant Activity of Polysaccharide from agaricus blazei Murill[J].Acta Edulis Fungi，2010，17（1）：69-71.（in Chinese）

[14]WANG Weijuan，FENG Cuiping，CHANG Mingchang，et al.Effects of polysaccharides from agaricus blazei murill on the antioxidant activity in lead-poisoning male rats[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2013，13（6）：15-19.（in Chinese）

[15]SUN Juan，ZHANG Zhaohui，LIU Lei，et al.Antioxidant activities of crude polysaccharides from four valuable edible fungi[J].Journal of Anhui Agricultural University，2011，38（3）：404-409.（in Chinese）

[16]DANG Lei，HAO Jiaxin，JIANG Haitao.Comparison of antioxidant activity of several edible fungus polysaccharides[J].Anhui Agricultural Science Bulletin，2010，16（5）：76-77.（in Chinese）

[17]WEN Yu.Comparison on nutritional components in fruiting bodies of tricholoma-matsutake from Heilongjiang[J].Journal of Anhui Agricultural Science，2010，38（6）：2943-2944.（in Chinese）

[18]YIN Xiulian，YOU Qinghong，JIANG Zhonghai，et al.Study on antioxidant activity of different polar solvent extracts and the effective substance of Tricholoma matsutake Sing[J].Food and Fermentation Industries，2011，37（5）：194-198.（in Chinese）

[19]LI Pingjing，ZHANG Ting，WANG Xiaoying，et al.The study of anti-fatigue action of pseudo-ginsenoside GQ on exhaustive mouses[J].Chinese Journal of Laboratory Diagnosis，2009，13（7）：869-871.（in Chinese）

[20]SUN Yushu，BILifu，SU Xiulan.General research situation ofpolysaccharides and polysaccharides medicine[J].Journal of Inner Mongolia Medical University，2006，28（1）：75-78.（in Chinese）

[21]MA Haitian，LIU Xijie.Effect of daidzein and cystamine on the blood concentration of insulin and glucagon in geese[J].Journal of Northeast Agricultural University，2002，33（3）：251-255.（in Chinese）