GPR50敲除導(dǎo)致小鼠神經(jīng)元數(shù)目和發(fā)育異常研究*

蘭麗君,陳繼博,呂美紅,馬全紅

蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所(蘇州 215123)

GPCRs 家族是體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)超家族，已鑒定出在人的基因組中有上千個(gè)基因編碼GPCRs[1]，雖然它們的序列同源性較低，但在結(jié)構(gòu)上都具有螺旋-環(huán)-螺旋的七次跨膜結(jié)構(gòu)，并且GPCRs中有一半是內(nèi)源性配體的受體，具有一個(gè)胞外端和胞內(nèi)端，通過偶聯(lián) G 蛋白和其他信號通路接受細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。GPCRs在神經(jīng)傳遞過程、細(xì)胞增殖、器官特異性中是非常重要的[2]。GPR50屬于 GPCRs 家族，是位于 X 染色體 Xq28 上的孤獨(dú) G 蛋白偶聯(lián)受體、褪黑激素相關(guān)受體(melatonin related receptor)[3-4]，主要分布在成年哺乳動物腦內(nèi)的垂體、下丘腦、海馬等多個(gè)部位，主要表達(dá)在神經(jīng)元上[5- 6]。已有相關(guān)研究表明：GPR50在很多精神類疾病，如：雙極情感障礙(Bipolar affective disorder，BPAD)、抑郁癥(Major depressive disorder，MDD)以及精神分裂癥(Schizophrenia)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有不可或缺的作用[7-10]。最近的研究亦發(fā)現(xiàn)：GPR50基因在ASD患者體內(nèi)有兩個(gè)突變位點(diǎn)：Δ502-505和T532A，而且這種突變只發(fā)生在男性個(gè)體上[11]。但是到目前為止，GPR50在大腦中的功能尚不清楚。

為了探究GPR50在大腦發(fā)育中的作用，我們首先分析了GPR50在不同時(shí)期的表達(dá)情況，又進(jìn)一步探究了GPR50對發(fā)育的影響，包括對神經(jīng)元數(shù)目和中間神經(jīng)元的影響，以及對樹突發(fā)育的影響。我們的結(jié)果顯示：GPR50敲除影響海馬區(qū)域鈣網(wǎng)膜蛋白(Calretintin，CR)陽性中間神經(jīng)元的數(shù)目，而不影響皮層深層和淺層神經(jīng)元的數(shù)目。另外，成年的GPR50敲除小鼠腦皮層錐體細(xì)胞的頂樹突方向異常。因此，GPR50在大腦發(fā)育中具有重要功能。

材料與方法

1 材 料 野生型小鼠C57BL/6J在蘇州大學(xué)提供的 SPF 級實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，C57BL/6J背景的GPR50敲除小鼠(G-/Y)和野生型小鼠(G+/Y)雜交來繁殖；GPR50 antibody(Santa Cruz)、γ-tubulin(Sigma)、Tbr1 antibody(Abcam)、Cux1 antibody(Santa-Cruz)、CR(Abcam)、FD Rapid GolgiStainTM Kit(FD Neuro Technologies,Inc)。

2 方 法

2.1 GPR50小鼠的基因鑒定：剪取長度約為0.5 cm的小鼠尾部組織，提取DNA。然后用如下的引物進(jìn)行PCR：引物PNF-seq5’-FATCCGGGGGTACCGCGTCGAG-3’；GPR50-zptR 5’-TACCTCCACCTCCTCCAGCAT-3’；GPR50-zptF5’-CAGAGTCACCTGGGACTTGCT-3’；LAR3 5’-CACAACGGGTTCTTCTGTTAG TCC-3’；GPR50-G-zptF 5’-CAGAGTCACCTGGGACTTGCT-3’；GPR50-G-wt-tR 5’-GTAGCAGTAACGGTTGATGGCAATG-3’。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。

2.2 Western blot檢測蛋白的表達(dá)：將E12、E14、E16、E18、P0小鼠用手術(shù)剪和鑷子取出全腦，立即置于冰上，并分離出皮層和海馬部分，用預(yù)冷的PBS清洗兩遍，再放入研磨器中，加入裂解液(Brain lysis buffer和蛋白酶抑制劑(1∶50))；在冰上進(jìn)行研磨裂解至腦組織成勻漿狀，測濃度，并在樣品中加入 4×上樣緩沖液混勻，使蛋白質(zhì)變性。配制12% SDS-PAGE分離膠和5%的SDS-PAGE濃縮膠，待凝固后按次序上樣，孵育GPR50抗體，以γ-tubulin作為內(nèi)參，凝膠成像儀進(jìn)行成像。

2.3 組織免疫熒光染色：將確定基因型的小鼠在體視顯微鏡下取出完整的腦組織。在4°C 條件下，用4%的多聚甲醛固定24 h，然后換成15%、30%的蔗糖梯度脫水沉底。用冰凍切片機(jī)橫切海馬區(qū)，切片厚度14 μm，貼在載玻片上。晾干后用0.3% TritonX-100洗3次，10 min每次。10%的FBS室溫封閉2 h。一抗Tbr1(特異標(biāo)記第六層神經(jīng)元的maker)、Cux1( 特異標(biāo)記淺層神經(jīng)元的maker)以及CR(特異標(biāo)記中間神經(jīng)元的maker)(1∶200)在4 °C條件下孵育過夜?；厥找豢梗?.3% TritonX-100洗3次，10 min每次。二抗Tbr1：Rabbit555，Cux1和CR：Rabbit 488(1∶800)在室溫避光孵育1 h，棄二抗，再次用0.3% TritonX-100洗3次，10 min每次。待切片避光晾干后用含DAPI的封片劑封片。

2.4 高爾基染色：將高爾基染色試劑盒內(nèi)的A、B液按1∶1震蕩混勻后放入4 ml的EP管中，避光貯存；第2天，取G+/Y、G-/Y小鼠大腦放到配好的AB液中，浸泡14～16d，注意避光；15d后，取出浸泡好的腦袋，蘸干AB液，準(zhǔn)備切片；將切片機(jī)的箱體溫度和凍臺溫度都調(diào)至-22℃，準(zhǔn)備好明膠包被過的片子，將腦袋放在-80℃冰箱內(nèi)40 min，然后再避光放到切片機(jī)中箱體溫度內(nèi)2 h，制作包埋劑座，固定腦袋，按100 μm切片貼于載玻片上，避光晾干。將晾干的片子放在玻片槽內(nèi)，用雙蒸水洗兩次，4min/次；用工作液浸泡10 min(工作液配制：溶液D、溶液E和雙蒸水按1∶1∶2配100 ml，現(xiàn)配現(xiàn)用)；用雙蒸水洗兩次，4 min/次；在50%、75%、95%乙醇中各清洗4 min；再在無水乙醇中洗4次，4 min/次；二甲苯中透明13 min；用中性樹脂封片，待拍片。

結(jié) 果

1 GPR50基因敲除小鼠的獲得和鑒定 為了研究GPR50在大腦中的作用，本研究利用了GPR50基因敲除(GPR50-/-)的小鼠。該小鼠在南京模式動物中心定做，GPR50的第二外顯子通過同源重組被lacZ-neo cassette序列替代(圖1)。GPR50基因敲除小鼠可正常存活、可繁育，且在體重、運(yùn)動等方面均無明顯異常。GPR50雜合子(GPR50+/-，雌性)小鼠通過與雄性C57BL/6N野生型小鼠回交進(jìn)行保種。因?yàn)镚PR50基因位于X染色體上，雌性GPR50+/-雄性野生型小鼠(WT)通過雜交可以獲得WT小鼠 (雌性或者雄性)、GPR50+/-(雌性)和GPR50-/Y(雄性)小鼠。通過提取小鼠尾巴基因組DNA，并利用對應(yīng)的引物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：圖中199號和200號小鼠為雜合子雌性小鼠，201為WT小鼠，205號為GPR50基因敲除的雄性小鼠。

2 GPR50在胚胎發(fā)育過程中有較高的表達(dá) 已有研究表明：GPR50主要分布在成年哺乳動物腦內(nèi)的垂體、下丘腦、海馬等多個(gè)部位，而在細(xì)胞水平上，則主要表達(dá)在神經(jīng)元上[5-6]。為了研究GPR50在大腦中的作用，我們首先取WT小鼠胚胎發(fā)育的不同時(shí)期(E12-P0)的腦組織，勻漿裂解后，通過Western blot檢測了GPR50蛋白在腦內(nèi)的表達(dá)情況，GPR50在發(fā)育的不同時(shí)期均有表達(dá)(圖3)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：從E12到E18有增加的趨勢，而從P18到P0呈現(xiàn)減少的趨勢(圖4)。這表明GPR50在大腦發(fā)育中發(fā)揮一定的作用。

圖1 GPR50基因敲除小鼠的獲得示意圖(GPR50的第二外顯子被敲除)

圖2 基因鑒定的PCR代表圖

圖3 GPR50在不同發(fā)育階段野生型小鼠腦內(nèi)表達(dá)

圖4 GPR50在不同發(fā)育階段野生型小鼠腦內(nèi)表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖

3 GPR50敲除不影響P1小鼠大腦皮層深層和淺層神經(jīng)元的數(shù)目 大腦皮層是高度特化且有著嚴(yán)格分層的結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外一共分為6層，即Ⅰ～VI層，每一層都有自己特有類型的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[12]。且它們的產(chǎn)生具有一定的時(shí)間和空間性，由SVZ區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞按照由內(nèi)而外的順序逐步分化而產(chǎn)生的，比如先產(chǎn)生深層神經(jīng)元，而后是淺層神經(jīng)元。每層神經(jīng)元產(chǎn)生的時(shí)間和數(shù)量都是受嚴(yán)格控制的[13]。在發(fā)育階段，神經(jīng)元產(chǎn)生的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和數(shù)量的變化會導(dǎo)致大腦發(fā)育異常，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病[14-15]。我們的前期工作已表明：GPR50亦在神經(jīng)干細(xì)胞上表達(dá)，且影響干細(xì)胞的增殖和分化[16]。因此，我們首先分析了GPR50敲除后對P1時(shí)期小鼠大腦皮層不同層的神經(jīng)元數(shù)目的影響。我們分別利用深層和淺層神經(jīng)元的特異性蛋白標(biāo)志物Tbr1和cux1(Tbr1是第VI層神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志物，Cux1是II-IV神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志物)在P1時(shí)期的小鼠腦內(nèi)進(jìn)行免疫熒光染色。如圖5～7所示：Tbr1+細(xì)胞定位于第VI層。然而，我們的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與WT組小鼠相比，GPR50敲除后并未影響深層神經(jīng)元的數(shù)目。利用同樣的方法，我們亦分析了淺層神經(jīng)元的數(shù)目有無變化，結(jié)果顯示：GPR50敲除組小鼠大腦皮層內(nèi)淺層神經(jīng)元(cux+細(xì)胞)的數(shù)目也無明顯改變。以上結(jié)果提示：在發(fā)育后期，GPR50敲除并不影響淺層和深層神經(jīng)元的數(shù)目。

4 GPR50敲除導(dǎo)致P1小鼠海馬CR陽性中間神經(jīng)元數(shù)目顯著增多 神經(jīng)環(huán)路是大腦神經(jīng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，神經(jīng)元與神經(jīng)元之間依賴于突觸相互聯(lián)系，這些彼此聯(lián)系的神經(jīng)元構(gòu)成一定的神經(jīng)環(huán)路來發(fā)揮大腦的高級功能。根據(jù)其在突觸聯(lián)系中的作用，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元主要可以分為興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元(中間神經(jīng)元)。雖然中間神經(jīng)元在大腦皮層總神經(jīng)元中的數(shù)目相對較少，僅占20%左右，但在神經(jīng)元環(huán)路功能上卻起到了至關(guān)重要的作用。已發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如癲癇、自閉癥、精神分裂癥等，均與中間神經(jīng)元環(huán)路發(fā)育異常有關(guān)。GABA能中間神經(jīng)元是腦中一種主要的抑制性神經(jīng)元，和興奮性神經(jīng)元一起起著腦內(nèi)興奮-抑制的動態(tài)平衡，CR+中間神經(jīng)元是GABA

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖5 P1時(shí)期G+/Y小鼠和G-/Y小鼠皮層anti-Tbr1抗體標(biāo)記的神經(jīng)元(紅色)和DAPI標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核(藍(lán)色)的代表圖

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖6 P1時(shí)期G+/Y小鼠和G-/Y小鼠皮層anti-Cux1抗體標(biāo)記的神經(jīng)元(綠色)和DAPI標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核(藍(lán)色)的代表圖

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖7 Tbr1陽性和Cux1陽性細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)圖

能中間神經(jīng)元的一種。因此，本研究亦探討了GPR50對中間神經(jīng)元的影響。我們的結(jié)果顯示：P1時(shí)期的海馬區(qū)CR+中間神經(jīng)元主要分布在DG區(qū)域的顆粒層細(xì)胞外側(cè)，GPR50敲除組的每張14 μm厚的切片中約(44±4)個(gè)CR+中間神經(jīng)元， WT組小鼠組數(shù)目則為(29±4)個(gè)，GPR50敲除組CR+中間神經(jīng)元數(shù)目顯著高于WT組小鼠，這個(gè)結(jié)果提示GPR50敲除后，抑制性中間神經(jīng)元增多，可能打破了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的抑制性與興奮性中間神經(jīng)元之間的平衡(見圖8)。

每只小鼠取10張片子，每組3只小鼠，

圖8 GPR50敲除增加海馬鈣網(wǎng)膜蛋白陽性中間神經(jīng)元數(shù)目。p1時(shí)期G+/Y小鼠和G-/Y小鼠海馬DG區(qū)用CR抗體標(biāo)記中間神經(jīng)元(綠色)和DAPI標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核(藍(lán)色)的代表圖

5 GPR50敲除導(dǎo)致大腦皮層錐體神經(jīng)元頂樹突方向紊亂 樹突發(fā)育是神經(jīng)系統(tǒng)功能形成的一個(gè)基本過程，神經(jīng)元之間的交流需要樹突和軸突之間形成突觸。樹突像一根分叉的天線，接受來自不同方位的軸突輸入來的信號，樹突的長度和分支多少決定其接受信號的廣度和強(qiáng)度。錐體神經(jīng)元是皮層內(nèi)一種主要類型的神經(jīng)元，它有一個(gè)頂樹突直接延伸到大腦皮層表面，和幾個(gè)從胞體伸出的基樹突。為了探索GPR50對樹突發(fā)育的影響，我們利用高爾基染色觀察樹突的形態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)：在WT組小鼠皮層內(nèi)，可以清晰可見頂樹突的形態(tài)，他們排列有序，均垂直地延伸至皮層表面，而在GPR50敲除小鼠皮層的在兩個(gè)半腦連接處，有的神經(jīng)元的頂樹突變短甚至消失，排列紊亂(見圖9)。

圖9 GPR50敲除小鼠皮層內(nèi)錐體神經(jīng)元頂樹突方向紊亂

討 論

在胚胎發(fā)育過程中，GPR50在大腦內(nèi)的表達(dá)，暗示GPR50可能參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。此外，我們亦發(fā)現(xiàn)：GPR50影響海馬區(qū)中間神經(jīng)元的數(shù)目和皮層錐體神經(jīng)元的頂樹突的發(fā)育，這些結(jié)果表明了GPR50在腦發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。事實(shí)上，已有大量數(shù)據(jù)證實(shí)GPR50是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子[7-10]。

我們發(fā)現(xiàn)GPR50 KO小鼠P1時(shí)期無論是深層還是淺層的神經(jīng)元數(shù)目并沒有變化，而我們之前的結(jié)果卻表明GPR50 KO小鼠來源的神經(jīng)干細(xì)胞在體外能更多的分化成神經(jīng)元[16]，我們推測：在發(fā)育早期，GPR50敲除首先導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化能力的增強(qiáng)，但在發(fā)育后期，GPR50敲除可能又會產(chǎn)生相反的作用，所以最終在發(fā)育后期神經(jīng)元數(shù)目并無明顯變化。另一方面，在發(fā)育后期，GPR50的敲除后，增多的神經(jīng)元可能發(fā)生了凋亡。所以，為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，在接下來的研究中，我們將分析不同發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元的數(shù)目和凋亡情況。對中間神經(jīng)元的檢測的結(jié)果初步顯示，GPR50 KO小鼠的海馬區(qū)CR+中間神經(jīng)元數(shù)目顯著增多。這提示GPR50 可能參與調(diào)控神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性和抑制間的平衡。目前，抑制和興奮性神經(jīng)元的失衡已經(jīng)被證明和多種神經(jīng)疾病聯(lián)系在一起，例如精神分裂癥、自閉癥和阿爾茨海默疾病等。但CR是GABA能中間神經(jīng)元眾多亞型中的一種，另外還包括小清蛋白 (Parvalbumin，PV)，生長抑素(Somatostain，SST)以及神經(jīng)肽 Y (Neuropeptide Y，NPY)等，因此，下一步我們將評估其他類型的中間神經(jīng)元，和通過腦電圖來確定GPR50在這方面的作用。

總之，我們通過本研究得出：①GPR50在胚胎發(fā)育過程中有較高的表達(dá)；②GPR50敲除后不影響P1小鼠大腦皮層深層和淺層神經(jīng)元的數(shù)目，但可以使CR陽性中間神經(jīng)元數(shù)目顯著增多；③ GPR50敲除也導(dǎo)致大腦皮層椎體神經(jīng)元頂樹突方向紊亂。

[1] Shigeki T, Kadowaki S, Haga T,etal. Identification of G protein-coupled receptor genes from the human genome sequence[J]. FEBS Lett, 2002，520(1-3): 97-101.

[2] Luttrell LM. Reviews in molecular biology and biotechnology: transmembrane signaling by G protein-coupled receptors[J]. Mol Biotechnol, 2008, 39(3): 239-264.

[3] Gubitz AK, and Reppert SM. Assignment of the melatonin-related receptor to human chromosome X (GPR50) and mouse chromosome X (Gpr50)[J]. Genomics, 1999, 55(2):248-251.

[4] Reppert SM, Weaver DR, Ebisawa T,etal. Cloning of a melatonin-related receptor from human pituitary[J]. FEBS Lett, 1996,386(2-3): 219-224.

[5] Hamouda HO, Chen P, Levoye A,etal. Detection of the human GPR50 orphan seven transmembrane protein by polyclonal antibodies mapping different epitopes[J]. J Pineal Res,2007,43(1):10-15.

[6] Sidibe A, Mullier A, Baroncini M,etal. Expression of the orphan GPR50 protein in rodent and human dorsomedial hypothalamus, tanycytes and median eminence[J]. J Pineal Res,2010,48(3):263-269.

[7] Manzini MC, Walsh CA. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two[J]. Curr Opin Genet Dev, 2011, 21(3): 333-339.

[8] Macintyre DJ, McGhee KA, Maclean AW,etal. Association of GPR50, an X-linked orphan G protein-coupled receptor, and affective disorder in an independent sample of the Scottish population[J].Neurosci Lett,2010,475(3):169-173.

[9] Gogtay N,Ordonez A, Herman DH,etal. Dynamic mapping of cortical development before and after the onset of pediatric bipolar illness[J]. J Child Psychol Psychiatry,2007,48(9):852-862.

[10] Thomson PA, Wray NR, Thomson AM,etal. Sex-specific association between bipolar affective disorder in women and GPR50, an X-linked orphan G protein-coupled receptor[J]. Mol Psychiatry,2005,10(5):470-478.

[11] Chaste P, Clement N, Mercati O,etal. Identification of pathway-biased and deleterious melatonin receptor mutants in autism spectrum disorders and in the general population[J].PLoS One,2010,5(7): e11495.

[12] Molyneaux BJ, Arlotta B, Menezes JRL,etal. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex[J].Nat Rev Neurosci,2007,8(6):427-437.

[13] Greig LC, Woodworth MB, Galazo MJ,etal. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity[J]. Nat Rev Neurosci, 2013,14(11):755-769.

[14] Reif A, Fritzen S, Finger M,etal. Neural stem cell proliferation is decreased in schizophrenia, but not in depression[J].Mol Psychiatry,2006,11(5): 514-522.

[15] Eisch AJ, Petrik D.Depression and hippocampal neurogenesis: a road to remission[J].Science,2012,338(6103):72-75.

[16] Ma YX, Wu ZQ, Feng YJ,etal. G protein coupled receptor 50 promotes self-renewal and neuronal differentiation of embryonic neural progenitor cells through regulation of notch and wnt/beta-catenin signalings[J]. Biochem Biophys Res Commun,2015,458(4):836-842.