XB130在胃癌組織中的表達及臨床意義

谷軍保，鮑學斌，馬 釗

(河南省人民醫(yī)院胃腸外科，河南 鄭州 450003)

胃癌是常見的惡性腫瘤，病死率居惡性腫瘤第2位[1]。胃癌的分子標志物是國內外研究的熱點，尋找與胃癌發(fā)病相關的新型靶向基因對其預后評估及綜合治療有重要意義。XB130是一種新被識別的蛋白，在脾臟和甲狀腺中表達較高，而在腦、腎、肺和胰腺中表達較低[2]；XB130是一種腫瘤啟動子，但在甲狀腺癌和人肺癌細胞系中XB130表達下調[2]。XB130不僅參與細胞增殖、存活，還參與信號傳遞，本身會受到Rac和細胞骨架的調控，參與c-Src通路的激活和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路活化，而這些通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到關鍵作用，提示XB130在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中也起到一定作用[3-5]。本研究旨在探討XB130在胃癌組織中的表達及其與胃癌分化程度、淋巴結轉移及患者生存期的關系，以期為胃癌的發(fā)病機制提供基礎數據，為胃癌的臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1標本來源收集2011年6月至2012年6月河南省人民醫(yī)院保存的胃癌組織標本及相應的癌旁組織(距離癌組織>5 cm處)標本各72例，男53例，女19例；年齡42～73歲，平均(58.3±6.2)歲；均經組織病理學檢查確診為胃癌，術前均未進行放射治療和化學治療。

1.2儀器與試劑總RNA分離試劑盒(美國Promega公司)，TaqDNA聚合酶(美國Thermo公司)，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)引物(上海生工生物工程股份有限公司)；組織破碎儀(德國Retsch公司)，低溫超速離心機(德國Hettich公司)，PCR擴增儀(美國Biorad公司)。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學法檢測胃癌及癌旁組織中XB130蛋白表達將石蠟切片置于二甲苯I、二甲苯II中各浸泡15 min；無水乙醇I、無水乙醇II及體積分數90%、80%乙醇中各浸泡10 min；于100 ℃檸檬酸鹽溶液中抗原修復15 min；0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.4～7.6)沖洗3次，每次5 min；體積分數3%過氧化氫-甲醇溶液中封閉內源性過氧化物酶10～15 min；蒸餾水沖洗，PBS清洗3次，每次5 min；血清封閉液室溫封閉30 min；吸去封閉液，滴加一抗，4 ℃ 過夜；取出后室溫放置復溫20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃溫箱孵育45 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加50～100 μL二氨基聯苯胺顯色工作液顯色5～10 min；置于PBS中終止顯色；蘇木精復染，脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。隨機抽查5個高倍視野，計數100個細胞，以陽性細胞數和著色深度進行判定。染色強度評分標準：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分率評分標準：細胞未染色為0分，<10%為1分，10%～49%為2分，50%～80%為3分，>80%為4分。將每張切片著色程度得分和陽性細胞百分率得分相乘即為最后得分，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～7分為陽性(++)，8～12分為強陽性(+++)；將“-”定為陰性表達，“+”、“++”、“+++”定為陽性表達。

1.3.2總RNA提取與純化取30 mg胃癌組織和癌旁組織研碎，放入裝有175 μL RNA裂解液的離心管中，充分混合后加入350 μL RNA 稀釋緩沖液，顛倒3～4次后在70 ℃下孵育3 min；室溫下13 000×g離心10 min；取澄清裂解液加入200 μL體積分數95%乙醇，混合后轉移到離心柱裝配體中，13 000 ×g離心1 min；在離心柱中加600 μL RNA 清洗液后13 000×g離心1 min；隨后將50 μL新鮮制備的脫氧核糖核酸酶孵育混合物直接加到離心柱內的膜上；25 ℃下孵育15 min，加入終止液，13 000×g離心1 min；RNA 洗液洗滌2次后用100 μL無核酸酶水洗脫、收集。

1.3.3cDNA的合成取1 μg總RNA、4 μL MgCl2、2 μL 25 mmol·L-1反轉錄10×緩沖液、2 μL 脫氧核糖核苷三磷酸混合液、0.5 μL 10 mmol·L-1重組核糖核酸酶抑制劑、0.5 μL通用引物、1 μL 禽成髓細胞瘤病毒反轉錄酶，加無核酸酶超純水使反轉錄體系至20 μL，對其進行的反轉錄程序，混勻快速離心1次，反應程序：42 ℃ 15 min、95 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min。反轉錄的cDNA置于-40 ℃冰箱保存，備用。

1.3.4實時定量熒光PCR法檢測胃癌及癌旁組織中XB130mRNA水平PCR體系包括8.2 μL無核水、10 μL PCR反應混合物(含熒光染料)、1 μL cDNA和0.8 μL引物，整個體系為20 μL，95 ℃熱啟動3 min；95 ℃變性3 s、60 ℃退火、延伸30 s，共40個循環(huán)。XB130 RNA引物序列：上游為5′-AGGAAACCCTACTGAAATGCAC-3′，下游為5′-GCACT-CCTCG-TCAATTTCCT-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)RNA 引物序列：上游為5′-CATGGAGAAGGCTGG-GG-3′，下游為5′-AAAGTTGTCATGGATGA-CC-3′。采用Image-pro plus軟件(美國Media Cybernetics公司)對XB130 mRNA表達水平進行分析。

2 結果

2.1胃癌和癌旁組織中XB130蛋白表達比較結果見圖1。72例胃癌組織標本中，XB130蛋白陽性表達26例，陰性表達46例，陽性表達率36.1%(26/72)；72例癌旁組織標本中，XB130蛋白陽性表達52例，陰性表達20例，陽性表達率72.2%(52/72)；胃癌組織中XB130蛋白陽性表達率顯著低于癌旁組織(χ2=16.200，P<0.05)。

A：胃癌組織；B：癌旁組織。

圖1胃癌和癌旁組織中XB130蛋白表達(免疫組織化學，×200)

Fig.1ExpressionofXB130proteiningastriccancertissuesandparacanceroustissues(immunohistochemistry，×200)

2.2XB130蛋白表達與胃癌分化程度、淋巴結轉移的關系結果見表1。低、中分化胃癌組織中XB130蛋白陽性表達率顯著低于高分化胃癌癌組織(χ2=5.786，P<0.05)，有淋巴結轉移者胃癌組織中XB130蛋白陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移者(χ2=4.281，P<0.05)。

表1XB130蛋白表達與胃癌分化程度、淋巴結轉移的關系

Tab.1RelationshipbetweentheexpressionofXB130proteinandthedifferentiationandlymphnodemetastasisofgastriccancer

病理特征nXB130-/例(%)+/例(%)χ2P分化程度 低、中分化3024(80.0)6(20.0)5.7860.016 高分化4222(52.3)20(47.6)淋巴結轉移 有2822(78.6)6(21.4)4.2810.038 無4424(54.5)20(45.5)

2.3胃癌和癌旁組織中XB130mRNA表達比較結果見圖2。胃癌組織和癌旁組織中XB130 mRNA相對表達量分別為1.52±0.46、3.28±0.51，胃癌組織中XB130 mRNA表達顯著低于癌旁組織(t=-21.744，P<0.05)。

圖2胃癌和癌旁組織中XB130mRNA的表達

Fig.2XB130mRNAexpressioningastriccancertissuesandparacanceroustissues

2.4XB130mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系結果見表2。高分化胃癌組織中XB130 mRNA表達顯著高于低、中分化胃癌組織(P<0.05)，有淋巴結轉移者胃癌組織中XB130 mRNA表達顯著低于無淋巴結轉移者(P<0.05)。

表2XB130mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.5XB130mRNA高表達者與XB130mRNA低表達者生存期比較按照XB130 mRNA表達量中位數2.22進行分組，高表達組36例，低表達組36例。高表達組患者的平均生存期為(37.040±14.826)個月，低表達組患者的平均生存期(21.529±11.789)個月，XB130 mRNA高表達胃癌患者的生存期顯著高于XB130低表達患者(t=9.121，P<0.05)；見圖3。

圖3XB130mRNA高表達患者與XB130低表達患者生存期比較

Fig.3ComparisonofthesurvivaltimebetweenthepatientswithhighandlowexpressionofXB130mRNA

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，是多因素多階段發(fā)展形成的，在危險環(huán)境長期暴露、幽門螺桿菌感染及飲食因素的共同作用下，胃黏膜細胞會產生多種活性因子，使細胞發(fā)生氧化應激、炎癥損傷，增殖與凋亡之間的平衡被打破，最終形成胃癌組織[6]。目前，已經證實的致癌基因有K-ras、p53、腺瘤性結腸息肉病基因、Bmi-1等[7-10]，但對于XB130與胃癌發(fā)生發(fā)展關系的研究報道較少。本研究旨在探討胃癌組織和癌旁組織中XB130的表達及其與胃癌分化程度、淋巴結轉移及患者生存期的關系，以期為XB130在胃癌的機制研究提供基礎數據。

XB130是一種新型接頭蛋白，位于染色體10q25.3，編碼由818個氨基酸組成的蛋白質，相對分子質量為130 000[3]。研究發(fā)現，XB130在人正常甲狀腺和脾臟組織中高表達，而在甲狀腺癌組織中低表達[11]。XB130可能是原癌基因，在正常組織中表達，可以維持正常細胞自我更新和遷移；同時，還有另外一套調控基因預防正常的細胞過度增殖和分化，當平衡被打破后，細胞增殖轉移失控，產生致癌作用[12]。原癌基因經典理論對正常組織中XB130高表達仍然保持“健康”做出了合理接受，眾所周知，基因和信號通路發(fā)揮致癌性或致病性作用依賴于上下分子的調控，所以同一基因可能會在不同組織類型的癌癥或癌癥的不同階段中發(fā)揮不同的作用[13-14]。有研究對應用氟尿嘧啶治療的胃癌患者進行檢測，發(fā)現XB130的下調會降低氟尿嘧啶敏感性，XB130低表達患者的預后較差，XB130高表達患者的生存率高于低表達患者，XB130可能是通過調控細胞增殖、細胞周期及轉錄通路發(fā)揮作用[15-16]。

本研究結果顯示，胃癌組織中XB130 蛋白和mRNA表達顯著低于癌旁組織；低、中分化腺癌組織中XB130表達低于高分化腺癌組織，伴有淋巴結轉移的胃癌組織中XB130表達低于未伴有淋巴結轉移者；XB130高表達者生存期長于XB130低表達者。以上結果表明，XB130在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮了抑制作用，胃癌的轉移及患者預后與XB130表達水平密切相關。

綜上所述，XB130可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程，調控XB130的表達有望成為胃癌靶向治療的新位點。

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