光動力療法對大鼠齲齒模型的防齲效果及機制

馬瑩瑩，鄒朝暉

(1.鄭州市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南 鄭州 450000；2.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院牙體牙髓科，天津 300070)

齲齒是在以細菌為主的多種因素影響下，口腔內牙體硬組織發(fā)生慢性進行性破壞性感染性疾病[1]，是與癌癥和心血管疾病并列的人類三大重點防治疾病之一[2]，研究齲病病因、尋找安全有效的防齲方法尤為重要。針對目前防齲方法的不足，有學者提出了光動力療法(photodynamic therapy，PDT)，該方法可有效殺滅細菌而不產(chǎn)生耐藥性[3]，在口腔感染性疾病的治療中有很好的應用前景[4-6]。研究證實，PDT能有效抑制變異鏈球菌生長[7-9]，對大鼠齲齒模型也有較好的防齲作用[10]。光敏劑是PDT的核心物質，血卟啉單甲醚(hematoporyrin monomethyl ethe，HMME)能產(chǎn)生較好的光動力效應。但關于以HMME為光敏劑的光動力療法(hematoporyrin monomethyl ether-photodynamic therapy，HMME-PDT)對大鼠齲齒模型的防齲作用及機制的研究尚少。本研究旨在探討HMME-PDT對大鼠齲齒模型的防齲效果及機制，為其用于齲病預防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物21 d鼠齡、斷奶的無特定病原體(specific pathogen free，SPF) 級Wistar雄性大鼠40只，體質量47.66～53.36 g，平均(50.51±2.85)g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供。

1.2細菌變異鏈球菌NCTC 10449由首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院提供。

1.3主要試劑及儀器HMME(上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)；氟化鈉(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基(trypticase soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基(trypticase soy broth，TSB)(北京陸橋技術有限責任公司)；致齲飼料(質量分數(shù))：蔗糖(56%)，全麥粉(6%)，精煉奶粉(28%)，苜蓿粉(3%)，脫水全肝粉(1%)，酵母(4%)，鹽(2%)；532 nm半導體激光器(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；THERMD型電熱培養(yǎng)箱(天津天宇技術實業(yè)有限公司)；VS-1300U 型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；光學顯微鏡(日本OLMPUS公司)；SS-550型掃描電鏡(日本SHIMADZU公司)；JS-1600小型離子濺金儀(北京和同創(chuàng)業(yè)科技有限責任公司)。

1.4實驗方法

1.4.1變異鏈球菌懸液的制備常溫下復蘇變異鏈球菌NCTC 10449，超凈工作臺內用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液接種于TSA上，置于電熱培養(yǎng)箱，37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h。涂片檢查，確定為純培養(yǎng)后挑取TSA平板上單個菌落置于盛有5 mL TSB的試管中，置于電熱培養(yǎng)箱，37 ℃下厭氧培養(yǎng)18～24 h，使其菌落數(shù)達到1×1011CFU·L-1，待用。

1.4.2大鼠齲齒模型的建立取21 d大鼠唾液培養(yǎng)，檢測大鼠口腔內固有細菌的定植情況，并于 21～23 d鼠齡期間喂以含有抗生素的飲用水(青霉素 200 mg·L-1，鏈霉素1 500 mg·L-1)。于24 d鼠齡時取唾液培養(yǎng)，檢測大鼠口腔內細菌的抑制狀況，培養(yǎng)結果為陰性后停藥。于25～27 d 鼠齡期間，以體積分數(shù)10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(3 mL·kg-1)，每日清晨1次，連續(xù)3 d 給大鼠口腔內每顆磨牙各面接種1×1011CFU·L-1的變異鏈球菌100 μL，處理后30 min內禁食禁水。并喂以致齲飼料，同時將變異鏈球菌菌液和飲用水按1100體積比混合，給大鼠飲用。于28 d鼠齡時采集大鼠口腔刺激性唾液(每只100 μL)進行培養(yǎng)，通過平板菌落計數(shù)確認大鼠口腔內變異鏈球菌定植成功(>1011CFU·L-1)，用于后續(xù)實驗。

1.4.3動物分組與處理將建模成功的40只大鼠隨機分為生理鹽水組、單純激光組、單純光敏劑組、氟化鈉組和HMME-PDT組，每組8只。各組大鼠用體積分數(shù)10%水合氯醛按3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，上頜牙齒操作時采取仰臥位，下頜牙齒操作時采取俯臥位，用眼科開瞼器撐開大鼠口腔，暴露磨牙進行處理；生理鹽水組大鼠用浸有 150 μL 生理鹽水的小棉球反復涂搽磨牙各面5 min；HMME-PDT組大鼠用浸有150 μL 40 mg·L-1HMME的小棉球放于磨牙各面上，避光孵育5 min后，用532 nm的半導體激光垂直照射磨牙牙齒各面，功率密度為 140 Wm·cm-2，照射時間為90 s，能量密度為 12.6 J·cm-2；單純激光組大鼠不進行光敏劑HMME處理，僅用532 nm的半導體激光垂直照射磨牙各面，照射時間、功率密度、能量密度均同HMME-PDT組；單純光敏劑組大鼠僅用浸有150 μL 40 mg·L-1HMME的小棉球放于磨牙各牙面上，避光孵育5 min，不進行激光照射；氟化鈉組大鼠用浸有150 μL 2 g·L-1氟化鈉溶液的小棉球反復涂搽磨牙各面5 min；各組大鼠每周處理1次，連續(xù)4周。

1.5觀察指標

1.5.1大鼠磨牙牙面變異鏈球菌菌落計數(shù)自 28 d 鼠齡開始，每次處理完大鼠磨牙后，由同一位實驗者用消毒棉式子按同一方向擦拭牙面，立即放入盛有2 mL消毒生理鹽水的離心管中，震蕩混勻，用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋至10-5，取 100 μL 懸浮液涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，37 ℃下恒溫厭氧培養(yǎng)48 h后，計算每升菌落數(shù)，用SPSS 16.0軟件將數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉換[lg(CFU+1)]。

1.5.2大鼠磨牙平滑面和窩溝Keyes計分實驗結束后(56 d時)處死大鼠，分組拔除牙齒，清水清洗，室溫干燥，品紅染色，流動清水沖洗掉多余的染液，室溫干燥后，制作磨牙縱剖面，光學顯微鏡下觀察齲齒情況，記錄各組磨牙Keyes計分[11]。因磨牙平滑面(頰面、舌面和鄰面)和窩溝(頜面)患齲率明顯不同，將其分別進行記分。根據(jù)齲損破壞程度分為4級：牙釉質層(enamel only，E)：齲壞僅僅局限于牙釉質；牙本質淺層(slight dentinal，Ds)：齲壞累及牙釉質及牙本質外層1/4以內；牙本質中層(moderate dentinal，Dm)：齲壞累及牙本質厚度的1/4～3/4；牙本質深層(extensive dentinal，Dx)：齲壞累及深度超過牙本質厚度的3/4，甚至穿透牙本質全層。根據(jù)齲損破壞范圍，將大鼠磨牙分為若干個牙面單位，將各組中每只大鼠磨牙相同面(平滑面、窩溝)相同級的齲分值相加，為此級的總齲分，總齲分除以8為每組平均Keyes計分。

1.5.3大鼠磨牙表面形態(tài)將牙齒放于體積分數(shù)10%的中性甲醛溶液中固定3 h，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，體積分數(shù)50%、70%、95%、100%乙醇梯度脫水，六甲基二硅胺烷浸泡3 min，干燥罐內干燥后，放入JS-1600小型離子濺金儀噴金，SS-550型掃描電子顯微鏡觀察磨牙表面形態(tài)[12]。

2 結果

2.1各組大鼠牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)比較結果見表1。時間因素對大鼠口腔變異鏈球菌的生長沒有影響(F=0.11，P>0.05)，處理因素對大鼠口腔變異鏈球菌的生長有影響(F=230.89，P<0.05)，且處理因素和時間因素存在交互效應(F=6.36，P<0.05)。生理鹽水組、單純光敏劑組、單純激光組大鼠牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第1、2、3、4周處理后HMME-PDT組和氟化鈉組大鼠牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)均少于生理鹽水組、單純光敏劑組和單純激光組(P<0.05)；除第4周HMME-PDT組大鼠牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)與氟化鈉組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，第1、2、3周處理后HMME-PDT組大鼠牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)均少于氟化鈉組(P<0.05)。

表1各組大鼠不同處理時間牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)比較

注：與生理鹽水組比較aP<0.05；與單純光敏劑組比較bP<0.05；與單純激光組比較cP<0.05；與氟化鈉組相比dP<0.05。

2.2各組大鼠平滑面齲齒Keyes計分比較結果見表2。各組大鼠平滑面齲齒均未檢出Dx級齲損；HMME-PDT組和氟化鈉組大鼠平滑面齲齒均未檢出Dm級齲損。生理鹽水組、單純光敏劑組和單純激光組大鼠平滑面齲齒E、Ds、Dm級齲損的Keyes計分兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HMME-PDT組、氟化鈉組大鼠平滑面齲齒E、Ds級齲損的Keyes計分均顯著低于生理鹽水組、單純光敏劑組和單純激光組(P<0.05)，但HMME-PDT組與氟化鈉組大鼠平滑面齲齒E、Ds級齲損的Keyes計分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2各組大鼠平滑面齲齒Keyes計分比較

注：與生理鹽水組比較aP<0.05；與單純光敏劑組比較bP<0.05；與單純激光組比較cP<0.05；“-”為未檢出。

2.3各組大鼠窩溝齲齒Keyes計分比較結果見表3。各組大鼠窩溝齲齒中，僅生理鹽水組檢出Dx級齲損。生理鹽水組、單純光敏劑組和單純激光組大鼠窩溝齲齒E、Ds、Dm 級齲損Keyes計分兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HMME-PDT組、氟化鈉組大鼠窩溝齲齒E、Ds、Dm 級齲損Keyes計分均顯著低于生理鹽水組、單純光敏劑組和單純激光組(P<0.05)，但HMME-PDT組與氟化鈉組大鼠之間窩溝齲齒E、Ds、Dm 級齲損的Keyes計分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3各組大鼠窩溝齲齒Keyes計分比較

注：與生理鹽水組比較aP<0.05；與單純光敏劑組比較bP<0.05；與單純激光組比較cP<0.05；“-”為未檢出。

2.4各組大鼠磨牙表面形態(tài)掃描電鏡顯示，生理鹽水組和單純光敏劑組大鼠牙釉質表面粗糙，凸凹不平，有大量凹坑狀脫礦區(qū)和劃痕(圖1A、圖1B)；單純激光組大鼠牙釉質表面相對光滑，有少量圓形凹坑并可見凹坑內熔融狀結構(圖1C)；氟化鈉組大鼠牙釉質表面相對光滑，脫礦區(qū)較少，并可見到脫礦區(qū)的再礦化(圖1D)；HMME-PDT組大鼠牙釉質表面較平整，點狀凹陷減少，深脫礦區(qū)少，且脫礦區(qū)域大多表淺(圖1E)。

A：生理鹽水組；B：單純光敏劑組；C：單純激光照射組；D：氟化鈉組；E：HMME-PDT組。

圖1各組大鼠磨牙表面形態(tài)掃描電鏡圖像

Fig.1Surfacemorphologyofrat′sodontoprisisdetectedbyscanningelectronmicroscopyimagesineachgroup

3 討論

齲病是口腔中以細菌為主的多種因素復合作用所導致的牙體硬組織慢性進行性感染性病損，主要表現(xiàn)為無機質的脫礦和有機質的分解，隨著病程進展，不僅破壞牙體組織，引起牙體缺損、牙痛、咀嚼功能減退或喪失，侵犯頜骨引起根尖周炎、骨髓炎等，甚至成為“慢性病灶”，嚴重影響機體的健康水平和生活質量。齲病預防一直是眾多學者關注的焦點。變異鏈球菌是主要致齲菌，致齲菌在口腔內的產(chǎn)酸耐酸等代謝活動是齲病發(fā)生的直接原因，通過有效抑制或殺滅致齲菌的生長可起到防齲的目的。

PDI是一種聯(lián)合光、光敏劑和組織中的氧分子，通過一系列的光化學反應選擇性破壞病變組織，以達到治療目的的新技術。在組織中加入光敏劑后，所有組織都會吸收，經(jīng)過一段時間后，光敏劑會被正常組織逐漸代謝清除，而選擇性潴留于病變組織中，隨后經(jīng)過適當波長光源照射后，光敏劑被激活，進一步將光能傳遞給周圍組織，產(chǎn)生對細胞具有毒性的自由基，直接殺死細胞；或與周圍的氧分子作用，產(chǎn)生活性氧分子(radical oxygen species，ROS)，ROS可以與組織內的重要生物大分子如核酸和脂質、蛋白質等發(fā)生氧化還原反應，造成生物大分子活性物質喪失，影響其新陳代謝，導致細胞的死亡[13]。

光敏劑是PDI的核心物質，本研究所選用的HMME是一種性能穩(wěn)定、組成單一、單態(tài)氧和活性氧物質產(chǎn)量多、在533 nm處具有特征吸收峰的光敏劑，能被532 nm的半導體激光有效激發(fā)，產(chǎn)生較好的光動力效應。氟化物應用于齲病預防已有多年，療效確切，但存在耐氟菌株產(chǎn)生、氟使用安全性等問題，PDI是通過單態(tài)氧和ROS殺傷細菌，不產(chǎn)生耐藥性，可重復使用，為齲病預防提供了一個新的途徑。鄒朝暉等[9]以20 mg·L-1的HMME為光敏劑，波長為 635 nm 的半導體激光為光源，在能量密度為 12.74 J·cm-2條件下照射變異鏈球菌形成的人工齲口腔生物膜90 s，能殺滅99.36%的變異鏈球菌。吳寶娣等[14]采用 20 mg·L-1的HMME溶液與變異鏈球菌定植的人工口腔生物膜37 ℃厭氧孵育 2 h，用 532 nm 激光照射90 s(光斑直徑為1 cm，功率密度為 140 mW·cm-2)，可抑制生物膜中99.64%的變異鏈球菌生長。本研究選用40 mg·L-1的HMME為光敏劑，532 nm半導體激光垂直照射牙面90 s(功率密度為140 mW·cm-2，能量密度為12.6 J·cm-2)，結果顯示，1、2、3、4周處理后，HMME-PDT組和氟化鈉組大鼠牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)均少于生理鹽水組、單純光敏劑組和單純激光組，而且HMME-PDT組在前3周的牙齒變異鏈球菌菌落數(shù)均低于氟化鈉組；另外，與生理鹽水組、單純激光組和單純光敏劑組相比，在光滑面或窩溝齲的各級齲損中，HMME-PDT組大鼠的Keyes計分均顯著降低，表明HMME-PDT對齲齒有明顯的預防作用，這一結果也與菌落計數(shù)中變異鏈球菌數(shù)量減少的結果相吻合，表明PDT可能通過抑制或殺滅變異鏈球菌，減少變異鏈球菌的數(shù)量，從而起到預防齲病的作用，這一結果也與其他學者的研究結果相同[10，15-16]。雖然HMME-PDT組在前3周對變異鏈球菌的抑制作用強于氟化鈉組，但2組Keyes計分比較差異無統(tǒng)計學意義，這表明防齲作用不僅與變異鏈球菌的數(shù)量減少有關，還可能與其他因素有關。掃描電鏡結果顯示，生理鹽水組和單純光敏劑組大鼠牙釉質表面粗糙不平，有大量的凹坑狀脫礦區(qū)和劃痕；單純激光照射組大鼠牙釉質表面相對于生理鹽水組和單純光敏劑組較光滑，脫礦區(qū)少且可見到熔融狀結構，表明激光照射可以改變牙齒表面結構；氟化鈉組和HMME-PDT組大鼠牙釉質表面相對光滑，脫礦區(qū)較少且表淺，氟化鈉組可見到部分脫礦區(qū)的再礦化。這一結果提示，雖然氟化鈉組抑制變異鏈球菌的能力較HMME-PDT組弱，但Keyes計分卻與后者沒有明顯差異的原因，可能與氟化鈉組釉質脫礦的再礦化現(xiàn)象有關。

綜上所述，HMME-PDT可通過減少變異鏈球菌數(shù)量、激光照射改變牙齒表面結構等對大鼠致齲模型起到明顯的預防作用，但如何提高PDT的效應值得進一步研究。

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