小RNA SbfR增強傷寒沙門菌動力和侵襲力

孫嘉遙，陸仁飛，趙昕，黃新祥

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

傷寒沙門菌（Salmonella entericaserovar Typhi，S.Typhi）是沙門菌屬中一種人類腸道致病菌，通常通過污染的食物由消化道進入人體。S.Typhi可侵襲進入小腸黏膜，并克服人體免疫吞噬細胞的殺傷作用，再經(jīng)血液進入肝脾等全身組織，造成嚴重的系統(tǒng)性感染——傷寒熱[1－2]。

細菌中存在大量的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），它們活躍參與細菌各個方面的基因表達調(diào)控[3－4]。根據(jù)作用方式可將ncRNA分為順式編碼RNA和反式作用RNA。其中，反式作用RNA大多＜200 nt，又稱為小RNA（sRNA）。sRNA往往在遠處有多個靶基因，且常在伴侶分子Hfq的協(xié)助下與靶mRNA形成不完全堿基互補配對發(fā)揮作用[5－6]。

本實驗室前期利用Solexa高通量測序技術(shù)進行了S.Typhi轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的長為138 nt的 sRNA，命名為SbfR（原名稱為T64）[7]，其基因序列位于yegD與一假定蛋白St00898基因之間。目前已對該sRNA進行了表達特性分析和相關(guān)菌株構(gòu)建[8]，但對其在S.Typhi中發(fā)揮的作用尚未深入研究。

本研究對已構(gòu)建的SbfR相關(guān)菌株進行表型和基因芯片分析，以查找表達差異基因，為后續(xù)尋找SbfR的靶基因提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 H：z66陽性S.Typhi野生株GIFU 10007（WT）為日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈。質(zhì)粒pBAD/Myc-HisA為 Promega公司產(chǎn)品。S.Typhi空載體株（WT＋pBAD/Myc-HisA）、S.Typhi SbfR缺陷株（△SbfR＋pBAD/Myc-HisA）、S.Typhi SbfR回補株（△SbfR＋pBAD/Myc-HisA-SbfR）由本實驗室制備及保存[8]。HeLa細胞購自上海生科院細胞庫。

1.1.2 主要材料與試劑 胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐西林、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Oxoid公司）；NaCl、NaOH、鹽酸、無水乙醇、異丙醇（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；L-阿拉伯糖、SYBR熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA酶Ⅰ快速DNA消化試劑盒（TaKaRa公司）；基因特異性引物合成（蘇州泓訊生物科技有限公司）；熒光染料 Cy3-dCTP、Cy5-dCTP（Amersham公司）；總RNA提取試劑盒（Qiagen公司）；檢測S.Typhi基因組的基因芯片（本實驗室制備保存）。

1.1.3 主要儀器 PCR儀（美國 ABI公司，型號2720）；NanoDrop ND-1000核酸紫外檢測儀（美國賽默飛世爾科技公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技公司，型號HERAEUSMegafuge）；核酸雜交儀（英國Roller-Blot公司，型號 hybridiser HB-3D）；基因芯片掃描分析系統(tǒng)（美國 Axon Instruments公司，型號Genepix personal 4100A）。

1.2 細菌培養(yǎng)

將S.Typhi空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補株的單菌落分別接種于2 mL LB培養(yǎng)基（含0.1 mg/mL氨芐西林），37℃、250 r/min振蕩過夜。第2天，1∶100轉(zhuǎn)接后以相同條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期[D（600 nm）≈0.4]，加入 0.2%（W/V）L-阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)30 min誘導(dǎo)SbfR表達。

1.3 細菌動力實驗

取培養(yǎng)的空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補株菌液各0.5μL，點種于含0.3%瓊脂的LB半固體平板，37℃靜置培養(yǎng)過夜，檢測動力圈直徑。實驗重復(fù)3次后進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 HeLa細胞侵襲實驗

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HeLa細胞。實驗前1 d將24×105個細胞按密度為1×105個/mL接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。按照MOI為20∶1的比例向每孔細胞中加入培養(yǎng)的空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補株菌液，繼續(xù)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90 min；棄上清液，用PBS將每孔輕緩吹洗3次。一半孔內(nèi)加入1 mL 0.5%（V/V）TritonX-100裂解細胞，孵育10 min后涂于LB平板，培養(yǎng)過夜后其克隆數(shù)代表黏附水平（以T0表示）；余下一半孔內(nèi)加入100 mg/L慶大霉素殺死胞外菌，繼續(xù)培養(yǎng)90 min后同樣以1 mL 0.5%（V/V）TritonX-100裂解細胞，過夜培養(yǎng)后計算單克隆數(shù)代表侵襲水平（以T90表示）。重復(fù)3次后進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 基因芯片檢測S.Typhi全基因組表達水平

為進一步研究sRNA SbfR增強S.Typhi動力和侵襲力的機制，利用本實驗室前期制備的基因芯片篩查SbfR缺陷株和SbfR回補株基因表達譜差異，Log2R的絕對值＞1為判斷差異顯著的標準。采用4 000 r/min離心收集SbfR缺陷株和回補株。使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，加入Cy3-dCTP、Cy5-dCTP進行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物與基因芯片于核酸雜交儀中雜交18 h，次日下午洗片、掃描，進行數(shù)據(jù)分析[9]。

1.6 qRT-PCR檢測有表達差異的4種基因的mRNA表達

挑選基因芯片中4種表達差異的基因fliA、fljB、sopE和prgJ進行qRT-PCR分析。將培養(yǎng)的SbfR缺陷株和回補株以4 000 r/min離心收集細菌。Trizol法提取細菌總RNA。取1μg總RNA，以下游引物為反轉(zhuǎn)錄引物，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，用上下游引物進行擴增，采用兩步法qRT-PCR（95℃ 150 s預(yù)變性，95℃ 10 s，65℃ 30 s，40個循環(huán)），其中5s為內(nèi)參基因，觀察相關(guān)基因在各菌株中的轉(zhuǎn)錄水平。所用qRT-PCR引物：5s上游 5′-TTGTCTGGCGGCAGTAGC-3′，下 游 5′-TTTGATGCCTGGCAGTTC-3′；fliA上游 5′-GCGATGCTGGATGAATTACG-3′，下游 5′-TCGGTTTCCGTCGCATTAC-3′；fljB上游 5′-CAACCGCTAGTGATTTAGTTT-3′，下 游 5′-CTGTCCCTGTAGTAGCCGTAC-3′；sopE上游 5′-GCAACACACTTTCACCGAGG-3′，下 游 5′-CGGGGTCTTTACTCGCACTA-3′；prgJ上游 5′-GACATTGTCTCGCTGGATGA-3′，下游 5′-TCTTGCGAAATAGCCAGCTC-3′。實驗重復(fù)3次后進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 sRNA SbfR對 S.Typhi動力的影響

細菌動力實驗結(jié)果顯示，與空載體株相比，SbfR缺陷株的動力圈明顯減?。╰＝17.44，P＜0.01），而回補株與對照株的動力圈大小基本一致。此結(jié)果表明sRNA SbfR可增強S.Typhi的動力。

圖1 3種菌株動力圈比較

2.2 sRNA SbfR對 S.Typhi侵襲力的影響

細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，與空載體株比較，缺陷株對HeLa細胞的侵襲能力顯著下降（t＝30.18，P＜0.01），而回補株與對照株侵襲力基本一致，說明sRNA SbfR可以促進S.Typhi對上皮細胞的侵襲。

圖2 3種菌株對HeLa細胞的侵襲力

2.3 基因芯片分析sRNA SbfR對S.Typhi轉(zhuǎn)錄組的影響

基因芯片篩查結(jié)果顯示，缺陷株與回補株的表達差異基因共有85個，主要為鞭毛、熱休克、酶等相關(guān)基因。其中與鞭毛相關(guān)基因10種，侵襲相關(guān)基因2種。具體下調(diào)的基因功能及表達差異見表1。

表1 SbfR缺陷株中下調(diào)的12種基因

2.4 4種差異表達基因的qRT-PCR驗證

qRT-PCR結(jié)果顯示，回補SbfR后fliA、fljB、sopE基因表達均上調(diào)（P均＜0.05），而prgJ表達水平不變（圖3）。qRT-PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本一致，表明SbfR可以促進S.Typhi鞭毛和侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。

圖3 qRT-PCR驗證基因芯片結(jié)果

3 討論

sRNA在S.Typhi基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。sRNA主要通過與靶mRNA形成不完全堿基互補配對發(fā)揮作用，其與靶基因的作用方式主要有兩種：①與靶mRNA局部結(jié)合形成雙鏈，干擾RNA酶E的降解作用，影響靶mRNA的穩(wěn)定性；②與靶mRNA的5′端結(jié)合，影響靶mRNA SD序列的二級結(jié)構(gòu)，從而影響靶基因的翻譯效率[10]。

鞭毛是細菌重要的動力結(jié)構(gòu)，在細菌致病過程中發(fā)揮重要作用。大約50個基因與鞭毛的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)關(guān)系可將這些基因分為三級。其中，flhDC為一級基因，調(diào)節(jié)下游所有二、三級鞭毛基因；fliA為二級基因，調(diào)節(jié)如fljB、fliC等三級鞭毛基因[11]。本研究中基因芯片和qRT-PCR檢測結(jié)果均顯示，SbfR通過上調(diào)二、三級鞭毛基因fliA、fljB等的表達，增強S.Typhi的運動能力。

S.Typhi穿過上皮層的過程中，首先黏附于腸上皮細胞表面，隨后侵襲進入靶細胞。這一過程需要多種侵襲、菌毛、鞭毛基因以及調(diào)節(jié)因子等參與[12]。sopE和prgJ分別編碼胍基交換因子和Ⅲ型分泌系統(tǒng)內(nèi)部棒狀蛋白，均可增強細菌對細胞的侵襲力[13－14]。本研究中sopE的 qRT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，而prgJ則存在矛盾，推測可能是由于實驗方法和閾值差異引起?；蛐酒蛁RT-PCR結(jié)果表明，sopE表達水平下調(diào)與鞭毛相關(guān)基因水平下降引起的動力減弱可能共同降低了S.Typhi對HeLa細胞的侵襲能力。

綜上，本研究通過S.Typhi動力和細胞侵襲表型實驗，發(fā)現(xiàn)sRNA SbfR可增強S.Typhi的動力和侵襲力；并分析了基因芯片和qRT-PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)sRNA SbfR可促進S.Typhi鞭毛相關(guān)基因（fliA、fljB）和侵襲相關(guān)基因（sopE）的轉(zhuǎn)錄。然而，研究結(jié)果雖表明SbfR對鞭毛和侵襲相關(guān)基因存在調(diào)控作用，但并未確定它們是否為SbfR的靶基因。因此SbfR靶基因的確定及其與靶基因的結(jié)合位點仍需進一步的研究確定。

[1]Akullian A，Ng′eno E，Matheson AI，et al.Environmental transmission of typhoid fever in an urban slum[J].PLoSNegl Trop Dis，2015，9（12）：e0004212.

[2]Douqan G，Baker S.Salmonella enterica Serovar Typhi and the pathogenesis of typhoid fever[J].Annu Rev Microbiol，2014，68：317－336.

[3]Lalaouna D，Simoneau-Roy M，Lafontaine D，et al.Regulatory RNAs and targetmRNA decay in prokaryotes[J].Biochim Biophys Acta，2013，1829（6/7）：742－747.

[4]Sedlyarova N，Shamovsky I，Bharati BK，et al.sRNA-mediated control of transcription termination in E.coli[J].Cell，2016，167（1）：111－121.

[5]Lee HJ，Gottesman S.sRNA roles in regulating transcriptional regulators：Lrp and SoxS regulation by sRNAs[J].Nucleic Acids Res，2016，44（14）：6907－6923.

[6]Smirnov A，Wang C，Drewry LL，et al.Molecular mechanism ofmRNA repression in trans by a ProQ-dependent small RNA[J].EMBO J，2017，36（8）：1029－1045.

[7]王哲鑫，吉瀅，趙昕，等.非編碼小RNA T64對傷寒沙門菌基因表達的影響[J].江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2014，24（4）：298－301.

[8]徐慧，袁一航，陸仁飛，等.傷寒沙門菌小RNA T64的功能[J].江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2016，26（4）：320－323.

[9]Sheng X，Huang X，Li J，etal.Regulation of sulfur assimilation pathways in Salmonella enterica serovar Typhi upon up-shift high osmotic treatment：the role of UhpA revealed through transcriptome profiling[J].Curr Microbiol，2009，59（6）：628－635.

[10]Le Pabic H，Germain-Amiot N，Bordeau V，et al.A bacterial regulatory RNA attenuates virulence，spread and human host cell phagocytosis[J].Nucleic Acids Res，2015，43（19）：9232－9248.

[11]Du H，Sheng X，Zhang H，et al.RpoE may promote flagellar gene expression in Salmonella enterica serovar Typhi under hyperosmotic stress[J].Curr Microbiol，2011，62（2）：492－500.

[12]Chaban B，Hughes HV，Beeby M，et al.The flagellum in bacterial pathogens：Formotility and awhole lotmore[J].Semin Cell Dev Biol，2015，46：91－103.

[13]Vonaesch P，Sellin ME，Cardini S，et al.The Salmonella Typhimurium effector protein SopE transiently localizes to the early SCV and contributes to intracellular replication[J].Cell Microbiol，2014，16（12）：1723－1235.

[14]Zhong D，Lefebre M，Kaur K，et al.The Salmonella type IIIsecretion system inner rod protein PrgJis partially folded[J].J Biol Chem，2012，287（30）：25303－25311.