基于LC-Triple TOF MS/MS技術(shù)分析杜仲不同藥用部位化學(xué)成分差異

嚴(yán) 穎，趙 慧，鄒立思，劉訓(xùn)紅，柴 川，王勝男，華愉教

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

杜仲(EucommiaulmoidesOilv.)是我國特有的名貴藥用植物，其樹皮、葉及雄樹花均可供藥用，分別稱為杜仲、杜仲葉及杜仲雄花。杜仲和杜仲葉收載于2015版《中國藥典》，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效，用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦５劝Y狀；杜仲還具有安胎之功效，亦用于妊娠漏血、胎動不安等癥狀[1]。杜仲雄花具有補(bǔ)肝利膽、通便、安眠等保健功效，且有很高的營養(yǎng)價值，目前已被批準(zhǔn)為新食品原料，備受市場關(guān)注[2-3]。現(xiàn)代研究表明，杜仲、杜仲葉及杜仲雄花均含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類等藥效成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗菌抗病毒、保肝護(hù)腎、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[2-5]。雖然三者來源于同一植物，其化學(xué)成分類型基本一致，但藥效卻有所不同。近年來，對杜仲類藥材的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用和品質(zhì)評價等方面[6-11]，尚未見杜仲、杜仲葉與杜仲雄花三者化學(xué)成分的整體變化或差異性化學(xué)成分研究。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系的定性和定量分析中，常用的質(zhì)譜技術(shù)有四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜及復(fù)合式串聯(lián)質(zhì)譜等[12]。采用高分辨質(zhì)譜能夠測得化合物的精確分子質(zhì)量，進(jìn)而獲得化合物的分子式，通過多級質(zhì)譜給出的化合物二級裂解碎片信息，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫資料，可以快速鑒定化合物結(jié)構(gòu)[13]。植物代謝組學(xué)即研究不同物種、不同基因類型或不同生態(tài)類型的植物在不同生長時期或者受某種刺激干擾前后的所有小分子代謝產(chǎn)物，并對其進(jìn)行定性、定量分析，找出代謝變化的規(guī)律[14-15]。本研究將借鑒植物代謝組學(xué)的思路和方法，采用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜法(LC-Triple TOF MS/MS)分析杜仲、杜仲葉與杜仲雄花三者化學(xué)成分的差異性，通過多元統(tǒng)計(jì)分析找出其中差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律，旨在為揭示杜仲不同藥用部位之間藥效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Triple TOFTM5600 System-MS/MS電噴霧飛行時間高分辨質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有Peakview1.2數(shù)據(jù)處理工作站；SIL-20A XR超快速液相色譜儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品；Anke TGL-16B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；BSA224S電子天平：德國賽多利斯公司產(chǎn)品；KQ-500B型超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水制備儀：美國Millipore公司產(chǎn)品。

松脂醇二葡萄糖苷(批號：111537-200501)、桃葉珊瑚苷(批號：111761-200601)、京尼平苷(批號：110749-200714)、京尼平苷酸(批號：111828-201102)、綠原酸(批號：110753-200413)、咖啡酸(批號：110885-200102)、蘆丁(批號：100080-200707)、紫云英苷(批號：11092001)、山奈素(批號：110861-201310)對照品：純度均大于99%，由中國食品藥品檢定研究院提供；松脂醇單葡萄糖苷(批號：151205)：成都克洛瑪生物科技有限公司產(chǎn)品；隱綠原酸(批號：12112605)、異綠原酸A(批號：12022803)：純度均大于98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司產(chǎn)品；異槲皮苷(批號：BCBB2943)：純度≥98%，美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇(批號：143135)：色譜純，江蘇漢邦科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸：均為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：Milli-Q超純水。

實(shí)驗(yàn)樣品：于2016年4月21日采自陜西省略陽縣郭鎮(zhèn)北河溝(海拔1 455 m，北緯105°42′53″，東經(jīng)33°23′6″)，每個藥用部位采收樣品5份(S1～S5為杜仲，S6～S10為杜仲葉，S11～S15為杜仲雄花)。杜仲樹皮堆積發(fā)汗至內(nèi)皮變紫褐色后曬干，杜仲葉于50 ℃烘干，杜仲雄花自然晾干。樣品經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOilv.的干燥樹皮、葉和雄花，留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～10 min(5%～10%B)，10～12 min(10%～15%B)，12～22 min(15%～20%B)，22～35 min(20%～30%B)，35～42 min(30%～60%B)，42～55 min(60%～85%B)，55～57 min(85%～5%B)，57～60 min(5%B)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500，氣簾氣壓力275.8 kPa，霧化氣壓力379.2 kPa，輔助氣壓力379.2 kPa，離子源溫度550 ℃，噴霧電壓-4 500 V，解簇電壓-100 V。

1.3 溶液制備

1.3.1對照品溶液 分別取適量的各對照品，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，配制成對照品溶液；分別取0.2 mL各對照品溶液，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇配制成混合對照品溶液。

1.3.2供試品溶液 精密稱取0.6 g樣品粉末，加入30 mL 50%甲醇，密閉，稱定質(zhì)量后，超聲處理(功率250 W，頻率30 kHz)20 min，放置冷卻，再次稱其質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量損失，過濾，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 樣品分析

采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱對分離條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的色譜分離條件。根據(jù)設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件，取供試品溶液進(jìn)樣分析。

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)和色譜圖導(dǎo)入Peakview1.2進(jìn)行峰匹配、峰對齊、濾噪處理等，結(jié)果保存為文本格式。將文本文件調(diào)整后導(dǎo)入SIMCA-P13.0進(jìn)行分析。采用主成分分析(PCA)法，通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達(dá)杜仲不同藥用部位的化學(xué)組成差異；采用SPSS軟件對樣品進(jìn)行聚類分析，觀察分組情況；再用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對各樣品進(jìn)行分類，其中R2X、R2Y越接近1，表示模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表示預(yù)測率高。根據(jù)PLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP>1)找到潛在的差異化學(xué)成分。采用t檢驗(yàn)驗(yàn)證多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異化學(xué)成分是否在單維統(tǒng)計(jì)中具有顯著性差異，其中P<0.05表示有顯著性差異。

1.6 差異化學(xué)成分的鑒定

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到主要差異化學(xué)成分的質(zhì)荷比、碎片離子信息等，結(jié)合HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)和METLIN(http:∥metlin. scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫搜索、標(biāo)準(zhǔn)品比對及文獻(xiàn)報道確定或推測化合物的結(jié)構(gòu)信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇作為提取溶劑時的提取效果，同時考察了超聲提取時間為10、20、40、60 min時對提取效果的影響。為了在最短時間內(nèi)達(dá)到理想提取效率，最終選擇用50%甲醇超聲提取20 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水及乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，梯度洗脫條件下樣品中各峰分離度的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫時，峰型較好且有良好的分離效果。最終確定的最佳色譜條件見1.2.1節(jié)。

2.3 樣品分析

根據(jù)設(shè)定的液相色譜-質(zhì)譜條件，取供試品溶液進(jìn)樣分析。杜仲不同藥用部位樣品在負(fù)離子模式下的LC-Triple TOF MS/MS基峰強(qiáng)度離子流(BPI)色譜圖示于圖1。

注：a.杜仲；b.杜仲葉；c.杜仲雄花圖1 杜仲不同藥用部位樣品的提取離子流(BPI)色譜圖Fig.1 LC-Triple TOF MS/MS base peak intensity (BPI) chromatograms of different medicinal parts of Eucommia ulmoides Oilv.

2.4 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1PCA及HCA分析 采用PCA法分析杜仲不同藥用部位樣品的差異性化學(xué)成分。結(jié)果顯示，PCA模型的R2X=0.984，Q2=0.978，表明該模型穩(wěn)定，預(yù)測能力較強(qiáng)。杜仲不同藥用部位PCA分析的散點(diǎn)圖(t1：0.558；t2：0.427)示于圖2，可以看出，杜仲不同藥用部位的代謝組可以很明顯地分開，各自聚為一類，說明杜仲、杜仲葉和杜仲雄花樣品之間的化學(xué)成分差異較大。對3組樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化變換，采用SPSS軟件對色譜圖進(jìn)行聚類分析研究。選用歐式距離平方作為樣品間的相似性測度，采用最遠(yuǎn)鄰距離的方法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果示于圖3?？梢钥闯?，杜仲、杜仲葉和杜仲雄花樣品能夠很明顯地分為3類，表明三者之間的化學(xué)成分差異較大，相對而言，杜仲葉與杜仲雄花樣品的化學(xué)成分更接近，而杜仲樣品與二者的差異更大。

2.4.2PLS-DA分析 用有監(jiān)督的模式識別方法PLS-DA分析杜仲不同藥用部位之間的差異變量，即差異化學(xué)成分。變量載荷評價參數(shù)值(VIP)用于描述變量的貢獻(xiàn)程度，通常以VIP>1的變量作為特征變量。首先對杜仲與杜仲葉樣品進(jìn)行PLS-DA分析，其得分圖示于圖4a，兩個樣品沿著PC1軸明顯分開。模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y=0.968，Q2=0.999)顯示，該模型有效可靠。VIP得分圖和柱狀載荷圖分別示于圖4b和4c，對兩組分類貢獻(xiàn)較大的差異性成分(VIP>1)共有121個特征峰。

對杜仲和杜仲雄花樣品進(jìn)行PLS-DA分析，在散點(diǎn)圖中，兩者可以明顯區(qū)分，示于圖5a。模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y=0.982，Q2=0.999)顯示其有效可靠。同樣，分析兩個樣品的VIP圖(圖5b)和柱狀載荷圖(圖5c)，顯示共有113個特征峰的VIP值大于1。

對杜仲葉和杜仲雄花樣品進(jìn)行PLS-DA分析，在散點(diǎn)圖中兩者可以明顯區(qū)分，示于圖6a。模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y=0.946，Q2=0.999)證明其可靠程度較高。VIP圖(圖6b)和柱狀載荷圖(圖6c)顯示，對兩組分類貢獻(xiàn)較大的差異性成分(VIP>1)共有114個特征峰。

2.5 差異化學(xué)成分鑒定及相對含量變化

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到的主要差異化學(xué)成分的質(zhì)荷比、碎片離子信息等，結(jié)合HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)和METLIN(http:∥metlin.scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫搜索、標(biāo)準(zhǔn)品比對及文獻(xiàn)[16-34]檢索，對VIP>1且p<0.05的差異化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，初步鑒定出23個差異化學(xué)成分。提取差異成分在各組樣品間對應(yīng)的峰面積代表其相對含量，對杜仲、杜仲葉和杜仲雄花樣品中同一物質(zhì)峰面積的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算，得到差異成分在三者間的相對含量變化，結(jié)果列于表1。

2.6 結(jié)果分析

PCA分析結(jié)果顯示，杜仲、杜仲葉和杜仲雄花樣品在PCA軸上沿PC1軸、PC2軸分開，可以看出杜仲不同藥用部位樣品分布在不同區(qū)域，分類結(jié)果較為理想，說明杜仲、杜仲葉和杜仲雄花樣品的化學(xué)成分存在明顯差異。同時觀察聚類分析譜系圖，在距離為20的位置，杜仲葉和杜仲雄花的樣品可以聚在一類，說明二者的化學(xué)成分更為接近。通過PLS-DA分析得到23個差異化學(xué)成分，它們在3組樣品中的相對含量呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。其中，杜仲中以桃葉珊瑚苷、去乙酰車葉草苷酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、Eucomoside B、松脂醇單葡萄糖苷的含量較高，均為木脂素類和環(huán)烯醚萜類成分；杜仲葉或杜仲雄花中以苯丙素類和黃酮類成分含量較高，其中杜仲葉中以綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、槲皮素-3-O-丙二?；?β-D-葡萄糖苷、異槲皮苷、紫云英苷、山奈酚、山奈酚-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷及槲皮素糖苷1的含量較高，杜仲雄花中以愈創(chuàng)木基丙三醇、咖啡酸、煙花苷、異綠原酸A、柚皮素、槲皮素糖苷2及槲皮素糖苷3的含量較高。

圖5 杜仲和杜仲雄花樣品的PLS-DA得分圖(a)、VIP得分圖(b)和柱狀載荷圖(c)Fig.5 PLS-DA scores plot (a), variable importance plot (b) and loading plot (c) of Eucommiae Cortex and Eucommiae Flos Male

圖6 杜仲葉和杜仲雄花樣品的PLS-DA得分圖(a)、VIP得分圖(b)和柱狀載荷圖(c)Fig.6 PLS-DA scores plot (a), variable importance plot (b) and loading plot (c) of Eucommiae Folium and Eucommiae Flos Male

序號No保留時間tR/min化學(xué)成分Chemicalconstituent分子式Formula測量值MS1主要二級質(zhì)譜峰MainpeaksofMS2相對含量變化Relativecontentvariation1?537桃葉珊瑚苷AucubinC15H22O9391123[M+HCOO]-345，183，165，139A>C>B2554去乙酰車葉草苷酸DeacetylasperulosidicacidC16H22O11389109[M-H]-227，209，183，165，147，121A>C>B3653愈創(chuàng)木基丙三醇GuaiacylglycerolC10H14O5213078[M-H]-165，121，97，93，89C>A>B4?847京尼平苷酸GeniposidicacidC16H22O10373113[M-H]-747232[2M-H]-211，193，167，149，121A>C>B51407槲皮素糖苷1Quercetinglycoside1C32H38O21757184[M-H]-803186[M+HCOO]-595，463，301B>C>A6?1496綠原酸ChlorogenicacidC16H18O9353087[M-H]-191，179，135B>C>A7?1541隱綠原酸CryptochlorogenicacidC16H18O9353088[M-H]-191，179，135B>C>A8?1582京尼平苷GeniposideC17H24O10433134[M+HCOO]-225，207，123A>C>B9?1675咖啡酸CaffeicacidC9H8O4179036[M-H]-135C>B>A10?1801松脂醇二葡萄糖苷Pinoresinol?di?O?β?D?glucopyranosideC32H42O16681234[M-H]-519，357，151A>B=C111907槲皮素糖苷2Quercetinglycoside2C27H30O17625138[M-H]-463，301，271，255，179C>B>A

續(xù)表1

注：標(biāo)*的化合物已與對照品比對確定；A表示杜仲，B表示杜仲葉，C表示杜仲雄花

3 討論

現(xiàn)代研究表明，在杜仲中相對含量較高的木脂素類化合物具有降壓、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝及抑制血小板活化因子等生理功能，是杜仲護(hù)腎的活性成分之一；環(huán)烯醚萜類化合物也以杜仲中含量較高，具有抗菌、抗炎、止痛、利膽、保肝、通便、降壓、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等生理功能，其中桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸為保肝、降血脂、降壓的活性成分；苯丙素類和黃酮類化合物以杜仲葉和杜仲雄花中含量較高，苯丙素類化合物具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、保肝護(hù)肝等生理功能，其中綠原酸是抗菌、抗病毒、抗氧化、降壓的活性成分，咖啡酸有降壓、抗氧化等生理活性；黃酮類化合物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等生理功能[4-5,32,35-37]?；钚猿煞趾康牟町惪赡鼙憩F(xiàn)為臨床藥效的差異。以降壓作用為例，杜仲葉在急性動物實(shí)驗(yàn)中，劑量為杜仲的2倍時，才呈現(xiàn)與杜仲相近的降壓效果。這是因?yàn)橹饕祲撼煞帜局仡惡铜h(huán)烯醚萜類[35]在杜仲中含量較多。此外，杜仲雄花水提液抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于杜仲和杜仲葉[38]，這可能與其黃酮含量較高有關(guān)。從本實(shí)驗(yàn)初步研究結(jié)果可見，杜仲、杜仲葉、杜仲雄花三者化學(xué)成分存在明顯差異，其臨床功效亦存在差異，有必要開展進(jìn)一步研究并建立關(guān)聯(lián)。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立了基于LC-Triple TOF MS/MS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)分析杜仲不同藥用部位中化學(xué)成分差異的方法，并對分析結(jié)果進(jìn)行探討。比較杜仲、杜仲葉和杜仲雄花中化學(xué)成分相對含量差異，僅僅是對三者臨床藥效差異的初步探討，由于杜仲、杜仲葉和杜仲雄花中整體化學(xué)成分的潛在差異，可能會導(dǎo)致其在體內(nèi)的吸收、代謝及效用有所不同，最終導(dǎo)致三者臨床使用不同。

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