蘆筍小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

馮曉斌，李換桃

（晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600）

蘆筍是一種名貴蔬菜，種植面積較大，是我國(guó)重要的出口創(chuàng)匯經(jīng)濟(jì)作物[1]。我國(guó)不是蘆筍的原產(chǎn)地，種質(zhì)資源匱乏，早期引進(jìn)的常規(guī)種或二代種產(chǎn)量低、品質(zhì)差、病害嚴(yán)重，而且品種混雜，已被國(guó)外淘汰。蘆筍為雌雄異株，由單基因M控制表達(dá)，雄株為Mm，雌株為mm。雄株具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗性強(qiáng)、壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此，選育全雄品種是蘆筍育種的重要目標(biāo)，進(jìn)行全雄育種首先要獲得超雄株MM，采用常規(guī)雜交育種方式一般需要8～10年，而利用小孢子培養(yǎng)獲得超雄株僅需要2年左右[2]。小孢子培養(yǎng)蘆筍不僅加快了育種進(jìn)程，而且獲得的超雄株高度純合，是一種高效快捷的方法。文章對(duì)蘆筍小孢子培養(yǎng)研究現(xiàn)狀進(jìn)行了闡述，并對(duì)存在的問(wèn)題和發(fā)展前景進(jìn)行了分析。

1 蘆筍小孢子發(fā)育途徑

蘆筍小孢子發(fā)育是雄核發(fā)育的一種途徑。蘆筍雄核發(fā)育是指花粉或小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成完整植株的過(guò)程[3]，主要包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育、生殖細(xì)胞發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞同時(shí)發(fā)育以及小孢子發(fā)育四種途徑。通常是由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞或小孢子通過(guò)均等的有絲分裂發(fā)育成胚狀體[4,5]，但在細(xì)胞分裂過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致多倍體或嵌合體的出現(xiàn)。其中小孢子發(fā)育途徑是將未成熟的花粉粒在單核期或雙核期時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，改變其原來(lái)的發(fā)育途徑，誘導(dǎo)成胚狀體的過(guò)程。該發(fā)育途徑的優(yōu)點(diǎn)是基因純合度高，誘導(dǎo)突變體幾率較大，能獲得大量的不同性狀的個(gè)體，可以為育種提供豐富的材料。

2 蘆筍小孢子培養(yǎng)的影響因素

2.1 供試材料基因型

供體材料的基因型是影響小孢子培養(yǎng)的重要因素[6]。不同基因型小孢子的誘導(dǎo)出胚情況差異較大，包括誘導(dǎo)出胚的難易程度和胚胎的誘導(dǎo)率[7]。賴本智等[8]研究發(fā)現(xiàn)，10個(gè)不同蘆筍品種之間的花藥誘導(dǎo)率差異較大。其中UC500W的誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)率達(dá)到53.3%，而UC157的誘導(dǎo)率為22.8%。

2.2 取樣時(shí)期

小孢子發(fā)育需要經(jīng)過(guò)四分體、單核期、雙核期階段，蘆筍小孢子培養(yǎng)的取樣時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)胚狀體非常關(guān)鍵。嚴(yán)準(zhǔn)等[9]研究認(rèn)為單核靠邊期是進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期。蘆筍小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾、花藥的形態(tài)特征、顏色及花蕾長(zhǎng)度具有一定的相關(guān)性。戴勇等[10]研究發(fā)現(xiàn)選取花蕾長(zhǎng)度為1.5～2.0 mm的蘆筍花藥小孢子進(jìn)行誘導(dǎo)，效果較好。

2.3 植株的生長(zhǎng)狀態(tài)

供試植株的生長(zhǎng)狀態(tài)影響著花粉的發(fā)育情況，對(duì)小孢子培養(yǎng)具有一定的影響。Falavigna等[11]研究認(rèn)為露地栽培的蘆筍雄核發(fā)育最好，長(zhǎng)日照溫度平均為白天25℃，夜間15℃培育的植株小孢子單核期誘導(dǎo)效果較好。

2.4 培養(yǎng)基及添加成分

基本培養(yǎng)基的類型和組成對(duì)蘆筍小孢子培養(yǎng)具有較大的影響。小孢子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有MS、Miller、N6、B5、NLN等，不同作物適合不同的培養(yǎng)基。嚴(yán)仁玲等[12]在對(duì)石刁柏花藥離體培養(yǎng)及單倍體植株再生的研究中得出，蘆筍花藥培養(yǎng)MS培養(yǎng)基比N6培養(yǎng)基效果好。

外源激素也會(huì)對(duì)蘆筍的小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生影響。陳海媛等[13]研究認(rèn)為，誘導(dǎo)蘆筍花藥培養(yǎng)的最佳組合為2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，誘導(dǎo)的愈傷組織效果較好，且可直接分化成芽。蔗糖是小孢子培養(yǎng)中常用的碳源，不僅提供能量，還能維持一定的滲透壓，有利于小孢子的胚胎發(fā)生。周維燕等[14]研究認(rèn)為蔗糖的適宜濃度為5%～8%，過(guò)高的濃度處理抑制花粉誘導(dǎo)。在小孢子培養(yǎng)基中添加活性炭、谷氨酰胺、硝酸銀等外源物質(zhì)可以吸附有害物質(zhì)，減輕褐化程度，提高誘導(dǎo)效果。

2.5 預(yù)處理

蘆筍小孢子培養(yǎng)研究中，對(duì)花藥進(jìn)行一定的預(yù)處理能夠提高胚狀體發(fā)生率。低溫刺激小孢子有利于啟動(dòng)雄核發(fā)育，溫度以4℃左右處理為宜。Peng等[15]研究得出，對(duì)蘆筍品種G459花蕾進(jìn)行4℃黑暗處理7～9 d，誘導(dǎo)小孢子出胚的效果較好。此外，他還提出在蘆筍小孢子培養(yǎng)前期進(jìn)行熱激處理對(duì)小孢子誘導(dǎo)出胚效果較好。Touraev等[16]研究也認(rèn)為熱激處理能啟動(dòng)小孢子發(fā)育成孢子體。

3 蘆筍小孢子培養(yǎng)后染色體的鑒定和加倍

3.1 染色體的倍性鑒定

倍性鑒定包括直接鑒定法和間接鑒定法。直接鑒定法主要是對(duì)植株分生快的部位進(jìn)行鏡檢，觀察確定染色體數(shù)目，如根尖、漸尖、幼葉等。杜勝利等[17]在對(duì)黃瓜倍性鑒定的研究中發(fā)現(xiàn)，用體細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)法可直接、準(zhǔn)確的進(jìn)行倍性鑒定。間接鑒定法的準(zhǔn)確度不如直接鑒定法，但卻簡(jiǎn)便易操作。常用的方法包括流式細(xì)胞儀鑒定法、葉片氣孔大小及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目鑒定法、植株形態(tài)觀察法等[18]。

3.2 染色體加倍

單倍體的染色體加倍方法有兩種，一種是自然加倍，一種是人工加倍。自然加倍率較低，現(xiàn)多采用人工加倍。秋水仙素是染色體加倍的常用化學(xué)誘變劑[19]。張?zhí)煜璧萚20]研究得出，用0.3%秋水仙素處理蘆筍單倍體7 d，染色體加倍效果最好，加倍率可達(dá)82.50%。

4 問(wèn)題與展望

我國(guó)對(duì)蘆筍花藥培養(yǎng)的研究較多，花藥培養(yǎng)技術(shù)也有了較大的提高，但是小孢子培養(yǎng)效果卻不理想，在對(duì)蘆筍的全雄育種中應(yīng)用的較少，發(fā)展進(jìn)度緩慢。小孢子培養(yǎng)過(guò)程中還存在胚狀體發(fā)生率低、二倍體率低、成苗率低，而嵌合體多、褐化率和玻璃化率高等問(wèn)題。因此，如何改進(jìn)小孢子培養(yǎng)技術(shù)是下一步研究的重點(diǎn)，高出胚率、高成苗率及高二倍體率將是蘆筍小孢子培養(yǎng)的主攻方向。蘆筍小孢子培養(yǎng)可以將控制雄性基因M快速分離出來(lái)，經(jīng)加倍獲得高度純合的超雄株。同時(shí)小孢子培養(yǎng)在蘆筍的抗性育種中具有較大的應(yīng)用前景，對(duì)抗逆性和抗病蟲(chóng)害的研究提供了較好的途徑，加快了蘆筍的抗性育種發(fā)展，且與分子標(biāo)記技術(shù)和基因工程技術(shù)結(jié)合將不斷推進(jìn)蘆筍育種進(jìn)程。