重金屬對魚類細胞系遺傳損傷和基因表達的影響

李狀狀，李 霞,2，王縉云，張曉雨，梁 艷

(1.大連海洋大學，遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連 116023;2.大連海洋大學，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

細胞培養(yǎng)是指將有機體內(nèi)的某一組織取出，使其分散成單個細胞，在人工條件下細胞存活、生長和分裂的技術。魚類細胞培養(yǎng)始于二十世紀六十年代，由Wolf等[1]建立了世界上第一個魚類細胞系——虹鱒(Oncorhynchusmykiss)性腺細胞系RTG-2,目前已報道的魚類細胞系超過280株。這些細胞系被應用于病毒學、毒理學、生理學、腫瘤及基因工程等多個研究領域，近幾年魚類細胞系作為環(huán)境污染物的監(jiān)測生物得到廣泛的重視。

環(huán)境污染物是指進入環(huán)境后改變環(huán)境的正常組成和性質(zhì)，進而直接或間接有害于人類與其他生物的物質(zhì)。近些年，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)快速發(fā)展，大量的污染物隨廢水及地表徑流排放到水體中，使水資源環(huán)境遭受了一定的破壞[2]。進入水體中的主要是重金屬(Cd、Cr、Zn等)、有機化合物(酚類化合物、有機農(nóng)藥、多環(huán)芳羥類等)、生物學性毒素(病菌、病毒等)等。其中重金屬的影響尤其嚴重。

篩選檢測水環(huán)境污染物的指示生物很重要。以往的工作主要是利用成體魚作為檢測指標，研究內(nèi)容包括污染物對魚體組織的損傷[3-5]、在魚體內(nèi)的富集和分布[6-7]及對魚類生長發(fā)育的影響[8-9]等方面。隨著魚類細胞系的建立，利用細胞系研究污染物的毒性效應[10-11]、遺傳學損傷[12-13]及對基因表達的影響[14-15]等方面的研究也有較多的報道。由于魚類自身具有排毒和免疫作用，所以只有污染情況達到一定程度時一些不良生理指標才能表現(xiàn)出來，并且個體間也有差異，靈敏度也較差。體外培養(yǎng)的魚類細胞可以直接和污染物接觸，具有靈敏度高、均一性好、觀察方便等特點，是毒理學研究理想的試驗材料。筆者綜述重金屬對魚類細胞系影響的研究進展，以期為環(huán)境監(jiān)測及細胞毒理學研究提供幫助。

1 重金屬對魚類細胞系的影響

重金屬可分為必需金屬和非必需金屬，約有45種。必需金屬是機體進行正常生理活動所不可缺少的，如Cu、Fe、Se、Zn、Mg、Co等。重金屬含量較低時，對有機體的生長發(fā)育有促進作用，但當濃度超過一定閾值時，就會對機體產(chǎn)生毒害作用[16]。非必需金屬包括Cd、Hg、Ag、Pb、Au等，它們不參與機體的代謝反應，濃度較低時就可對機體產(chǎn)生毒性效應。我國水體中可檢測的重金屬有Cd、Cr、Zn、Cu、Pb、Ni、Hg、Fe等，其中危害程度較大的是Cd、Cr、Zn、Cu和Pb[17]。

1.1 重金屬對細胞系的毒性研究

早在1968年Rachlin等[18]首次利用體外培養(yǎng)的胖頭鯉(Pimephalespromelas)肌肉細胞系檢測環(huán)境中Zn的毒性作用，得出細胞存活率與鋅離子濃度之間呈正相關毒性效應。以后利用魚類細胞系進行重金屬的毒性效應及毒理學研究工作廣泛開展起來。Babich等[19]研究了幾種重金屬對BF-2細胞系的毒性作用，結(jié)果顯示重金屬毒性大小為Ag>Hg>Cd>Zn>Cu>Co>Ni>Mn>Sn>Pb>Cr(三價)。Maraeine等[20]研究了6種重金屬對虹鱒RTG-2細胞系的毒性效應，得出重金屬毒性大小為Hg>Cd>Zn>Cu>Pb>Ni。Tan等[21]研究了4種重金屬對草魚(Ctenopharyngodonidellus)鰭條細胞系、草魚腎細胞系、鯉魚(Cyprinuscarpio)上皮瘤細胞系、斑點叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)卵巢細胞系，褐色大頭魚(Brownbullhead)肌肉細胞系和胖頭鯉肌肉細胞系6種魚類細胞系的毒性作用，結(jié)果表明6種細胞系對4種重金屬的敏感性大小為Cr和Cd>Zn>Cu，Cu對草魚腎細胞系比其他細胞系毒性更強，而Cr和Zn對鯉魚上皮瘤細胞系比其他細胞系毒性更強，Cd是對胖頭鯉肌肉細胞系毒性最強的重金屬，4種重金屬對草魚鰭條細胞系、胖頭鯉肌肉細胞系均表現(xiàn)為中度毒性，Cu對褐色大頭魚細胞系毒性最低，其余重金屬均表現(xiàn)為中度毒性，認為草魚腎細胞系、胖頭鯉肌肉細胞系、鯉魚上皮瘤細胞系可作為重金屬毒性應急評估較為敏感的生物檢測指標。以上研究可以看出，Hg和Cd兩種重金屬在已研究的細胞系中表現(xiàn)為強毒性，Zn和Cu兩種重金屬對大多數(shù)細胞系表現(xiàn)為中度毒性，而其他重金屬對不同細胞系或同一種魚不同組織的細胞系則表現(xiàn)出強弱不同的毒性效應。分析認為，Hg和Cd作為有毒的重金屬，其能夠競爭性的替換Ca2+、Fe2+、Zn2+等金屬離子在膜轉(zhuǎn)運蛋白上的結(jié)合位置，通過改變Ca2+等其他離子通道大量進入細胞，進而造成細胞毒性[22]。

吳迪等[23]研究發(fā)現(xiàn)二倍體泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)鰭細胞系對重鉻酸鉀的敏感性高于三倍體泥鰍鰭細胞系。譚鳳霞等[10]研究Zn2+、Cd2+、Cu2+和Cr6+4種重金屬對稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)鰭細胞系的毒性作用時發(fā)現(xiàn)，4種重金屬對稀有鮈鯽鰭條細胞系的毒性效應均隨著傳代代數(shù)的增大而下降。以上研究結(jié)果說明細胞類型以及傳代次數(shù)對重金屬的吸收能力有一定的影響，這可能與細胞內(nèi)金屬硫蛋白基因的分類與分布不同相關，從而引起細胞對重金屬的隔離與解毒能力的差異[24]。

不同重金屬形態(tài)(是指重金屬的價態(tài)、結(jié)合態(tài)、化合態(tài)和結(jié)構態(tài)4個方面，即重金屬元素在環(huán)境中以某種離子或分子存在的實際形式)對細胞系毒性效應不同[25-26]。Babich等[19]研究了18種金屬鹽對BF-2細胞系的毒性作用，結(jié)果顯示陰離子配合物毒性為亞砷酸鹽>重鉻酸鹽>鉻酸鹽>砷酸鹽>亞硒酸鹽>高錳酸鹽>硒酸鹽。Goswami等[11]研究了Zn和Cd不同二價鹽對印度鯉科魚類Labeorohita鰭細胞系中的毒性，發(fā)現(xiàn)毒性排序為CdCl2

納米級新型材料在工業(yè)生產(chǎn)與科學研究中被廣泛應用，是生物學(化妝品、牙膏等)、醫(yī)學(藥品)和物理學(光學，通信工程等)應用必不可少的納米材料。由于其化學成分和納米尺度特征，研究其潛在毒性對生物系統(tǒng)的影響具有重要意義。Fernández等[27]研究評估新型材料氧化鋅納米顆粒、ZnO和Zn2+對魚類細胞株(RTG-2，RTH-149和RTL-W1)的細胞毒性潛力，指出氧化鋅納米顆粒的毒性顯著高于整體ZnO和Zn2+。Munari等[28]研究了用甲基聚乙二醇(M-PEG)包被的CdS量子點和硫化銀對RTG-2細胞系的細胞毒性，并發(fā)現(xiàn)CdS量子點在高質(zhì)量濃度(10 μg/mL和50 μg/mL)表現(xiàn)出高度細胞毒性，而Ag2S不顯示細胞毒性效應。已有研究發(fā)現(xiàn)，這些新型納米材料既可使原有重金屬的毒性增強(ZnO-NPs)，也可使有毒重金屬變?yōu)闊o毒重金屬(Ag2S)，納米顆粒的毒性來自它們具有更大的反應性和潛在增加細胞攝取重金屬的能力[29-30]。因此研究重金屬生產(chǎn)的新型材料對解決水環(huán)境污染問題、更新和補充重金屬的排放標準有著非常大的作用。

1.2 重金屬對魚類遺傳學損傷性的研究

遺傳學損傷是指體內(nèi)如DNA、RNA等遺傳物質(zhì)和相關的物質(zhì)載體等受內(nèi)外因素影響，導致遺傳物質(zhì)或者載體等發(fā)生損傷(如斷裂、缺失等)，引起的系列遺傳的生理病理改變的現(xiàn)象。細胞凋亡率、單細胞電泳形成的彗星拖尾率等以及微核率是常用的檢測DNA損傷的指標，是評價環(huán)境中有毒物質(zhì)對細胞造成遺傳損傷的一項非常有意義的參數(shù)[31]。細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡，它在多細胞生物清除異常細胞、調(diào)節(jié)細胞免疫反應等方面起著至關重要的作用[32]，而重金屬能夠誘導細胞凋亡，且凋亡率與重金屬含量呈正相關。項黎新等[33]用Cd2+、Cr6+、Hg2+、Cu2+、As5+和Pb2+等重金屬離子進行脅迫誘導草魚ZC7901細胞，經(jīng)末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP切口末端標記法檢測后發(fā)現(xiàn)6種重金屬均能誘導細胞發(fā)生凋亡。Wang等[34]采用DNA斷裂分析和流式細胞技術研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉能夠通過氧化應激誘導野生細鱗鯻(Theraponjarbua)鰭細胞系(JF細胞)產(chǎn)生細胞凋亡。Krumschnabel等[12]應用SUB-G1法[30]測定鎘和銅引起虹鱒鰓和肝細胞系細胞凋亡。Morcillo等[35]研究重金屬Cd、Hg、MeHg(甲基汞)、As和Pb對金頭鯛(Sparusaurata)SAF-1細胞系的遺傳毒性，結(jié)果表明凋亡細胞數(shù)目隨著重金屬濃度的增加而增加。

彗星試驗是一種在單細胞水平上通過測定細胞的拖尾率和遷移長度來檢測DNA微損傷的方法。白麗雯等[36]采用該方法研究CuSO4對松江鱸(Trachidermusfasciatus)腎細胞系的DNA損傷作用，發(fā)現(xiàn)CuSO4可以導致松江鱸腎細胞發(fā)生拖尾和遷移，且拖尾率和遷移長度在半致死質(zhì)量濃度時與對照組存在差異顯著(P<0.05)。筆者利用該方法研究了氯化鋅和硫酸銅分別對不同倍性泥鰍鰭細胞系的DNA損傷程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著重金屬含量的逐漸增大，細胞的拖尾率和遷移長度均逐漸增大，在高含量時與對照組存在極差異顯著(P<0.01)。

檢測重金屬對細胞系DNA損傷的另外一個指標是微核率[37]。重金屬污染可使細胞有絲分裂產(chǎn)生異常形成微核，微核是有絲分裂后期無著絲粒的染色體片段或染色體單體滯留在細胞質(zhì)中形成的，一般呈圓形或橢圓形。在污染物脅迫下，成體魚紅細胞微核率變化已成為重要的檢測指標，但在魚類細胞系鮮有報道。吳迪等[23]的研究發(fā)現(xiàn)不同倍性泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)鰭細胞系的微核率隨著重鉻酸鉀含量的增大，二倍體和三倍體泥鰍鰭細胞系的微核率均先升高后下降，且三倍體細胞系微核率高于二倍體細胞系。認為微核率出現(xiàn)下降的原因是Cr6+含量過高時，抑制細胞的正常分裂或使細胞核完全裂解，造成微核率降低。但也有報道認為微核率與重金屬濃度呈正相關的關系。白麗雯等[36]研究發(fā)現(xiàn)隨著CuSO4含量的增大松江鱸腎細胞系的微核率逐漸增大，最高達14.33‰。由此可見微核率可作為重金屬的檢測指標。

1.3 重金屬對魚類細胞系基因表達的影響

在細胞內(nèi)與重金屬結(jié)合的主要是金屬硫蛋白。金屬硫蛋白是一種低分子量富含半胱氨酸的具有必需金屬和非必需金屬離子解毒的金屬結(jié)合蛋白[28]。重金屬離子誘導的金屬硫蛋白基因的表達，已被證明在隔離和解毒各種重金屬離子中發(fā)揮重要的作用[37]。金屬硫蛋白的一個顯著特點就是在轉(zhuǎn)錄水平上能夠被環(huán)境中的重金屬所誘導。當外界重金屬元素含量達到一定值時誘導MT表達，且MT表達水平的高低與重金屬含量直接相關。Chan等[38]研究Cu2+、Hg2+、Cd2+、Zn2+4種重金屬對斑馬魚(Daniorerio)肝細胞系ZFL金屬硫蛋白基因表達量時，得出Cd2+是對體外細胞系金屬硫蛋白基因的表達最有力的誘導劑。Minghetti等[13]應用微列陣技術研究3種重金屬(Cu、Zn和Cd)對金頭鯛細胞系SAF-1金屬硫蛋白基因的表達影響，研究得知，Cu、Zn和Cd均能增加金屬硫蛋白基因的表達量。吳迪等[39]利用實時定量PCR技術研究發(fā)現(xiàn)重鉻酸鉀可誘導二倍體泥鰍鰭細胞系(DIMF)金屬硫蛋白基因表達量顯著升高。Cheuk等[40]運用RT-PCR方法研究了不同重金屬(Zn2+、Cd2+、Cu2+、Hg+、As3+、As5+、Cr3+和Cr6+)對斑馬魚肝細胞系ZFL和斑馬魚尾鰭細胞系SJD金屬硫蛋白基因金屬調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(MTF-1)mRNA誘導表達情況，結(jié)果表明每種金屬離子均可誘導SJD細胞系MTF-1 mRNA水平的表達，并且發(fā)現(xiàn)Zn2+和Cd2+在兩個細胞系均為最強誘導劑。這與Chan等[38]研究的結(jié)果一致。

也有報道，某些重金屬離子選擇性的增加某些細胞系內(nèi)金屬硫蛋白基因的表達。Cheuk等[40]運用RT-PCR方法研究了不同重金屬(Zn2+、Cd2+、Cu2+、Hg+、As3+、As5+、Cr3+和Cr6+)對斑馬魚ZFL細胞系(肝)金屬硫蛋白基因金屬調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(MTF-1)mRNA誘導表達情況，發(fā)現(xiàn)只有Zn2+，Cd2+，Cu2+，Hg2+和As3+可引起ZFL細胞MTF-1 mRNA水平的表達。Yan等[14]用DNA步移法和瞬時表達分析對幾種重金屬對斑馬魚尾鰭細胞系(SJD.1)MT基因啟動子的調(diào)控作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)Cu2+、Cd2+、Zn2+對SJD.1細胞系MT基因轉(zhuǎn)錄有明顯感應，而Hg2+、Ni2+、Pb2+和Co2+無明顯感應。

重金屬誘導MT基因的表達還受其它因素的影響。Vergani等[41]研究細胞信號生長因子(GH)與重金屬之間的干擾作用時，發(fā)現(xiàn)所有重金屬誘導的MT-A(金屬硫蛋白異構體)表達水平均高于MT-B(金屬硫蛋白異構體)，但當重金屬結(jié)合GH時有差異，對于MT-B Zn2+/GH和Cd2+/GH沒有干擾，Hg2+/GH具有負面干擾；對于MT-A，Zn2+/GH和Hg2+/GH沒有干擾，Cu2+/GH具有負面干擾和Cd2+/GH具有正面干擾。Magda等[42]研究發(fā)現(xiàn)魚類細胞內(nèi)的谷胱甘肽可以螯合重金屬離子減少對細胞的毒性作用。

重金屬不僅影響與其結(jié)合的特異性基因表達，也對其他基因如熱應激蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白基因、特殊酶基因等表達產(chǎn)生影響。Deane等[43]利用RT-PCR技術研究重金屬(Cd2+，Cu2+和Ni2+)誘導黑鯛成纖維細胞系熱休克同源蛋白HSC70和熱休克蛋白HSP70轉(zhuǎn)錄表達水平發(fā)現(xiàn)誘導HSP70對環(huán)境中重金屬污染物有強響應。Minghetti等[13]應用微列陣技術研究3種重金屬(Cu、Zn和Cd)對金頭鯛細胞系SAF-1銅轉(zhuǎn)運ATP酶(ATP7A)基因的表達影響，發(fā)現(xiàn)只有Cu可以增加ATP7A mRNA基因的表達水平，且其表達受MT基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。Torre等[15]利用實時熒光定量PCR測定CdCl2、HgCl2、As2O3和K2Cr2O7對魚類PLHC-1細胞系ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因表達量的影響時發(fā)現(xiàn)，不同的重金屬與特定的ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因特異性相互作用，調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和功能水平。可見重金屬對應激蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達影響比較大，并且ATP7A轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達受金屬硫蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。重金屬可以調(diào)節(jié)魚類的許多細胞反應途徑，并刺激多種基因的表達，因此，魚類細胞系在探究水體中重金屬對魚體組織的影響機理起著重要的作用。

2 展 望

相對于活體魚而言，魚類細胞系對水體中的重金屬反應更為敏感、快速。將魚類細胞系作為水環(huán)境中重金屬檢測以及毒性應急評估的生物指標，對于建立科學的重金屬排放標準、防治環(huán)境污染、保障養(yǎng)殖生產(chǎn)以及人類健康有著非常重要的意義。傳統(tǒng)的研究是在試驗條件下進行細胞的培養(yǎng)并進行環(huán)境污染物的毒理學研究，細胞生長環(huán)境與實際水環(huán)境還是有一定不同。Schnell等[44]設計了一種體外魚鰓培養(yǎng)系統(tǒng)[42-44]，則解決了上述問題。建立魚類細胞直接和待測試水環(huán)境接觸的快速檢測體系，是未來研究的重點。

環(huán)境中重金屬種類眾多，重金屬是怎樣調(diào)控凋亡基因表達的？轉(zhuǎn)運蛋白如何誘導細胞攝取較多的重金屬的？仍有許多重金屬對細胞的作用機理等需要進一步深入研究。

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