內(nèi)生菌對(duì)葡萄生長(zhǎng)發(fā)育及釀造的影響研究進(jìn)展

南立軍，李雅善，崔長(zhǎng)偉，寧娜，楊俊梅，徐成東*，范樹(shù)國(guó)，許碩星

（1. 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/楚雄師范學(xué)院高原特色葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，云南楚雄 675000；2. 昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南昆明 650550）

葡萄酒顏色的穩(wěn)定性是葡萄酒的重要特征之一，葡萄酒從貯存、運(yùn)輸?shù)截浖芷陂g顏色、口感和香氣的平衡，及葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)、健康與安全都受到葡萄酒顏色穩(wěn)定性的影響。因此，生產(chǎn)顏色純正且穩(wěn)定的葡萄酒是保證葡萄酒質(zhì)量的關(guān)鍵瓶頸。

葡萄酒發(fā)酵過(guò)程是由各類(lèi)微生物和酶參與的復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程[1]。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，葡萄梗、籽、皮和果肉中的糖、酸、色素、單寧、蛋白質(zhì)、膠體和香氣物質(zhì)等通過(guò)浸漬、發(fā)酵和生化反應(yīng)等相互滲透、結(jié)合、分解、轉(zhuǎn)化[2]，導(dǎo)致葡萄酒顏色處于動(dòng)態(tài)變化之中。發(fā)酵結(jié)束后，少量的微生物和酶在陳釀階段仍然殘存在葡萄酒中，繼續(xù)分解、代謝和轉(zhuǎn)化葡萄酒中的成分。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間陳釀后，微生物和酶代謝底物基本被消耗殆盡，繼續(xù)代謝其它的物質(zhì)或副產(chǎn)物[3]，這些持續(xù)不斷的代謝活動(dòng)引起葡萄酒顏色的變化。因此，葡萄酒陳釀期間顏色的變化起源于葡萄酒的發(fā)酵，一直延續(xù)到葡萄酒的陳釀，直至貨架期。發(fā)酵結(jié)束后的陳釀期仍然伴隨著漫長(zhǎng)的各類(lèi)微生物參與的生化反應(yīng)過(guò)程，使葡萄酒處于動(dòng)態(tài)狀態(tài)——香氣、色澤和口感等外部感官特征和內(nèi)部成分之間的動(dòng)態(tài)發(fā)展之中。

內(nèi)生菌（Endophytic）是由外源微生物侵入并在長(zhǎng)期的共生過(guò)程中形成的內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌，一般不引起明顯病害癥狀[4-5]。內(nèi)生菌作為重要的微生物，目前研究較多的是對(duì)葡萄中產(chǎn)白藜蘆醇內(nèi)生菌的篩選和特性的研究。白藜蘆醇作為重要的酚類(lèi)物質(zhì)，與葡萄和葡萄酒中的色素類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)，可以改變葡萄酒的顏色[6-7]；內(nèi)生菌除了產(chǎn)白藜蘆醇之外，也產(chǎn)色素類(lèi)物質(zhì)或者與色素類(lèi)物質(zhì)結(jié)合或反應(yīng)的相關(guān)物質(zhì)，影響葡萄酒的顏色，究竟是哪一類(lèi)內(nèi)生菌產(chǎn)色素類(lèi)物質(zhì)，需要進(jìn)一步研究。葡萄酒陳釀是一個(gè)多種微生物共存的復(fù)雜過(guò)程。葡萄酒顏色通常會(huì)隨著陳釀明顯降低，影響因素有哪些？?jī)?nèi)生菌如何影響葡萄酒陳釀期間顏色的變化？如何通過(guò)內(nèi)生菌調(diào)節(jié)葡萄酒顏色的變化？需要科學(xué)系統(tǒng)地研究，揭示規(guī)律，趨利避害，保持葡萄酒的穩(wěn)定。

我國(guó)各產(chǎn)區(qū)風(fēng)土特點(diǎn)突出，四季分明、晝夜溫差大，其獨(dú)特的風(fēng)土和自然環(huán)境條件在決定葡萄酒優(yōu)良品質(zhì)的同時(shí)，也極大地影響了葡萄酒顏色的變化。篩選和確定高產(chǎn)和穩(wěn)定色素類(lèi)物質(zhì)的內(nèi)生菌及其菌落構(gòu)成，結(jié)合內(nèi)生菌的次級(jí)代謝作用及其機(jī)理研究葡萄果實(shí)中各成分之間的轉(zhuǎn)化、紅葡萄酒釀造和陳釀期間代謝指標(biāo)和顏色指標(biāo)的變化對(duì)紅葡萄酒顏色變化的影響，分析確定紅葡萄酒貯藏期間顏色穩(wěn)定的原因，最終揭示內(nèi)生菌對(duì)紅葡萄酒貯藏期間顏色的穩(wěn)定性機(jī)理，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。因此，釀酒葡萄內(nèi)生菌的篩選及其研究開(kāi)發(fā)對(duì)于葡萄酒顏色的穩(wěn)定和質(zhì)量安全有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析

葡萄及其產(chǎn)品葡萄酒主要由水、糖、酸、色素類(lèi)、酚類(lèi)、蛋白質(zhì)、膠體、香氣物質(zhì)及礦物質(zhì)等組成，這些物質(zhì)之間相互溶解、分解、結(jié)合、轉(zhuǎn)化，影響葡萄和葡萄酒顏色的變化。因此，葡萄和葡萄酒的顏色與這些成分息息相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：

1.1 內(nèi)生菌的特性及功能

近年來(lái)，有關(guān)內(nèi)生菌的研究主要集中在植物內(nèi)生菌的多樣性、影響寄主植物生理生化的內(nèi)部機(jī)制、與寄主植物相互作用產(chǎn)生活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用等方面。內(nèi)生菌還能影響葡萄離體細(xì)胞的生理生化狀態(tài)，但是不同內(nèi)生菌的影響效應(yīng)不同。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌能產(chǎn)木質(zhì)素酶、酚氧化酶、纖維素酶和漆酶等，分泌化感物質(zhì)抑制其它植物生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量有機(jī)物并降解有害物質(zhì)；產(chǎn)生多種抑制酵母菌和霉菌生長(zhǎng)的有益物質(zhì)和具有抑菌活性和化感作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物及抗氧化物質(zhì)。有些內(nèi)生菌寄生在多種寄主體內(nèi)，有些僅出現(xiàn)在某種或幾種特定寄主體內(nèi)，極少數(shù)幾種具有寄主專一性。這些內(nèi)生菌與寄主形成互利共生關(guān)系，誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生高活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)提供活性物質(zhì)，參與活性成分合成，轉(zhuǎn)化次級(jí)代謝產(chǎn)物，為發(fā)掘新的生物活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。這些內(nèi)生菌通過(guò)共生參與葡萄酒發(fā)酵和陳釀，產(chǎn)生各種生物活性物質(zhì)，影響葡萄酒顏色的變化[8]。

內(nèi)生菌的菌群組成具有多樣性。目前內(nèi)生菌株篩選的目標(biāo)主要是篩選產(chǎn)白藜蘆醇的內(nèi)生菌株[9]。劉婭等[10]篩選出了高產(chǎn)白藜蘆醇的內(nèi)生菌C2J6，并確定為黑曲霉。曾芹等[9]從釀酒葡萄‘美樂(lè)’的葡萄皮、穗軸及果梗中篩選出產(chǎn)白藜蘆醇的內(nèi)生菌株，鑒定為鏈格孢屬菌。因此，內(nèi)生菌在產(chǎn)白藜蘆醇方面有多樣性。王朝霞等從煙臺(tái)地區(qū)葡萄根部分離出了1331株19屬內(nèi)生菌，其中以鐮孢屬Fusarium（33.9%）、Ilyonectria（17.35%）和柱孢屬Cylindrocarpon（15.7%）為優(yōu)勢(shì)菌群[11]。在受污染的葡萄皮中也分離鑒定出了鐮刀菌，并篩選了10個(gè)降解酶類(lèi)，其中的聚半乳糖醛酸酶和木聚糖酶能夠引起水果變質(zhì)[12]。前人通過(guò)形態(tài)鑒定、排重、ITS排序、系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建確定了釀酒葡萄的優(yōu)勢(shì)菌群為青霉、交鏈孢霉、鐮刀菌，其中鐮刀菌屬的6株菌對(duì)3種指示菌均有抑制作用，具有抵抗釀酒葡萄病原真菌活性的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，嫩葉內(nèi)生菌的分離率和多樣性指數(shù)明顯低于成熟葉和老葉，這些內(nèi)生菌通過(guò)葡萄成熟采收進(jìn)入葡萄酒，影響葡萄酒品質(zhì)[14]。Pamoda等[15]從仙人掌中分離的抗菌活性最強(qiáng)的鐮刀菌屬中分離的伊快霉素能夠幫助寄主抵御脅迫環(huán)境，起保護(hù)色作用。除此之外，安榮艷等[16]也初步篩選鑒定出用于“人工貴腐酒”釀造的灰葡萄孢菌株，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

內(nèi)生菌的潛在危害也非常嚴(yán)重。多次傳代后，內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定、生物特性退化[17]，引起葡萄酒顏色的嚴(yán)重退化，其機(jī)理需要進(jìn)一步研究。內(nèi)生菌種類(lèi)和數(shù)量的變化會(huì)影響葡萄酒顏色的變化。綜上分析，內(nèi)生菌來(lái)源廣泛，種類(lèi)繁多，同一種內(nèi)生菌能夠產(chǎn)多種活性物質(zhì)；有些內(nèi)生菌具有正面作用，有些具有負(fù)面作用，因此內(nèi)生菌具有保護(hù)葡萄酒和污染葡萄酒的雙重作用，這與內(nèi)生菌的作用機(jī)制有關(guān)。

1.2 內(nèi)生菌與葡萄生長(zhǎng)發(fā)育

“七分原料，三分工藝”。所以，葡萄酒品質(zhì)主要由葡萄品質(zhì)和釀酒工藝共同決定，而葡萄品質(zhì)（葡萄中的糖、酸、酚類(lèi)、蛋白質(zhì)、維生素等成分）是決定葡萄酒品質(zhì)的首要條件，影響其品質(zhì)的因素主要有葡萄品種、環(huán)境條件、栽培措施等。因此，環(huán)境因子內(nèi)生菌對(duì)葡萄品質(zhì)有重要影響。內(nèi)生真菌對(duì)葡萄葉片和果實(shí)中各生理生化指標(biāo)也有影響，而且不同內(nèi)生真菌的影響差異顯著。

崔艷莉等[18]采用組織塊培養(yǎng)法從‘赤霞珠’不同組織部位均分離到了內(nèi)生酵母菌，初步鑒定為瓶形酵母（Pityros purom）和克勒克酵母（Kleckera），為國(guó)產(chǎn)內(nèi)生酵母菌的篩選鑒定奠定了基礎(chǔ)。劉旭等[19]從染病葡萄植株的健康葉片中分離56株內(nèi)生菌，從中篩選到對(duì)葡萄霜霉?。≒lasmopara viticola）有明顯拮抗效果的菌株，并初步將其中的CS5菌株鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus amyloliquefaciens），為葡萄霜霉病菌的生物防治提供了基礎(chǔ)。王增福等[20]從釀酒葡萄植株的各組織中分離出的462株內(nèi)生真菌中篩選出64株內(nèi)生真菌。采用ITS排序、系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建確定了20個(gè)屬釀酒葡萄內(nèi)生真菌，其中包括3個(gè)優(yōu)勢(shì)種群交鏈孢霉（Alternaria）、青霉（Penicillium）、鐮刀菌（Fusarium）；同時(shí)確定了對(duì)病原真菌有抗性的15個(gè)屬，其中鐮刀菌屬的6株菌對(duì)3種指示菌均有抑制作用，是釀酒葡萄植株主要抗病原真菌的因素之一，這為葡萄生物抗菌研究提供了基礎(chǔ)。申紅妙等[21]采用電擊轉(zhuǎn)化法將含有GFP基因的質(zhì)粒pGFP78導(dǎo)入枯草芽孢桿菌JL4中，并成功得到表達(dá)GFP的生防菌JL4-gfp，同時(shí)采用葉片噴霧法接種、抗生素平板分離回收后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)10次傳代培養(yǎng)后的標(biāo)記菌株對(duì)葡萄霜霉菌保持原有的抑菌作用；定殖在葉片內(nèi)部14 d后檢測(cè)不到接種菌株；噴霧3 d后的室內(nèi)生防菌對(duì)葡萄霜霉病的防治效果達(dá)88.0%以上，但7 d后無(wú)明顯防效。JL4-gfp的定殖量與其防治葡萄霜霉病的效果呈正相關(guān)，這為明確枯草芽孢桿菌JL4在葡萄葉表面和內(nèi)部的定殖情況，研究定殖與防治效果的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。馬勉娣等[22]研究發(fā)現(xiàn)，再接種內(nèi)生真菌改變了‘玫瑰蜜’葡萄葉片內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)和分布，增加了‘玫瑰蜜’葉中內(nèi)生真菌的數(shù)量和優(yōu)勢(shì)度，降低了內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)；噴施農(nóng)藥提高了內(nèi)生真菌的多樣性，但降低了內(nèi)生真菌的分離率，表明再接種內(nèi)生真菌能夠改善葡萄葉片的健康狀況，這對(duì)葡萄植株的生長(zhǎng)和果實(shí)品質(zhì)的改善有重要影響。黃治鈺[23]將分離、篩選出的9株內(nèi)生菌接種于‘玫瑰蜜’葡萄幼葉，果實(shí)成熟后內(nèi)生真菌對(duì)葉面積及新梢節(jié)間大小無(wú)顯著影響，但是不同菌株侵染顯著改變了葡萄葉片中原有內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)；葉片總黃酮、總酚和還原糖含量顯著降低，還原能力有所增強(qiáng)，VC含量有不同程度增加，總蛋白質(zhì)含量有所降低；毛殼菌屬（Chaetomiumsp.）和炭角菌屬（Xylariasp.）能夠提高果實(shí)的體積和質(zhì)量、果穗的整體成熟度；果實(shí)中，毛科菌屬使可滴定酸和總黃酮含量顯著增加；炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）顯著增加還原糖含量?？稻У萚24]依次采用硫酸銨鹽析、疏水相互作用層析及離子交換層析從黑曲霉YY-22發(fā)酵產(chǎn)酸果膠粗酶液中分離較高純度的果膠裂解酶（PL）、聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠酯酶（PE），結(jié)果表明，65%硫酸銨對(duì)PL回收率最大，分離出部分雜蛋白；經(jīng)Phenyl-Sepharose FF疏水相互作用層析分離出PE，又經(jīng)Q-Sepharose HP交換層析分別得到PG和PL，為進(jìn)一步研究酶的基本性質(zhì)及其在葡萄酒中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。PL、PG和PE是葡萄中重要的三類(lèi)酶，參與葡萄中重要色素類(lèi)物質(zhì)的分解和釋放[25]。這三類(lèi)酶可以從黑曲霉YY-22中分離獲得。因此，黑曲霉YY-22是參與葡萄中重要色素類(lèi)物質(zhì)分解和釋放的重要內(nèi)生菌。

總之，內(nèi)生真菌可以在一定程度上改變葡萄葉片原有內(nèi)生真菌的菌群結(jié)構(gòu)，影響葡萄葉片和果實(shí)的生理生化狀態(tài)及葡萄品質(zhì)。這些內(nèi)生菌及其影響效應(yīng)隨著葡萄酒釀造進(jìn)入葡萄酒中，影響了葡萄酒發(fā)酵，甚至陳釀，這為進(jìn)一步探討內(nèi)生真菌對(duì)葡萄酒的品質(zhì)調(diào)控效應(yīng)和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

因此，內(nèi)生菌對(duì)葡萄葉片和果實(shí)的影響是非常顯著的，一方面，內(nèi)生菌隨著發(fā)酵進(jìn)入葡萄酒中，通過(guò)生化反應(yīng)分解葡萄和葡萄酒中的成分影響葡萄酒的品質(zhì)，另一方面，內(nèi)生菌通過(guò)影響葡萄葉片和果實(shí)的成熟，影響葡萄中養(yǎng)分的積累，從而影響葡萄酒的品質(zhì)。

1.3 內(nèi)生菌與酚類(lèi)物質(zhì)的關(guān)系

1.3.1 葡萄酒中的色素類(lèi)物質(zhì)及其影響因素

葡萄酒中酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)于葡萄酒品質(zhì)至關(guān)重要。酚類(lèi)物質(zhì)具有促進(jìn)和抑制葡萄酒氧化的雙重功能[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵和陳釀過(guò)程中，葡萄酒中的酚類(lèi)物質(zhì)相互聚合，或參與一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，引起結(jié)構(gòu)和含量的變化[27]?；ㄉ辗肿有　⑷芙舛雀?、不穩(wěn)定，可以自聚，與輔色素共呈色，或與乙醇、糖、肽和單寧類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)[28]。黃烷-3-醇類(lèi)中的兒茶素、表兒茶素縮合成單寧在葡萄酒中聚合成原花青素，再與花色苷結(jié)合成聚合色素，酚酸（如咖啡酸、香豆酸等）與花色素和酒石酸結(jié)合，影響葡萄酒色度與顏色穩(wěn)定性。山葡萄酒中加入葡萄糖氧化酶顯著減緩總花色苷和二甲花翠素-3,5-雙葡萄糖苷的降解速率[29]。這些變化與花色素β環(huán)的羥基化形式有關(guān)。隨β環(huán)羥基數(shù)目增加，藍(lán)色會(huì)加深；而隨β環(huán)甲基化程度增強(qiáng)，紅色也會(huì)增強(qiáng)[28]，這與內(nèi)生菌的作用密切相關(guān)。

陳釀期間酚類(lèi)物質(zhì)復(fù)雜多變。花色苷類(lèi)賦予葡萄酒色澤，但是從陳釀開(kāi)始緩慢下降[30]，這與蛋白質(zhì)、多糖和濃縮單寧的沉淀作用及其不可逆的、復(fù)雜穩(wěn)定的花色苷衍生物有關(guān)，也與由花青素或黃烷三醇縮合成的聚合物花青素及其衍生物有關(guān)[31]。游離花色苷降解或聚合色素導(dǎo)致酒體逐步由紅紫色漸變?yōu)榇u紅色。游離花色苷能與多糖和肽反應(yīng)，花色苷及其?；锱c其它酚類(lèi)化合物形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性較強(qiáng)的紅褐色或黃色聚合物，如吡喃花色苷和聚合色素。新葡萄酒中的花色素在陳釀期間結(jié)合成大分子縮合單寧，促進(jìn)色素沉淀[32]。溶解氧會(huì)促進(jìn)其聚合及氧化降解[33]。升溫和酒瓶頂隙體積的增加不利于刺葡萄酒中酚類(lèi)物質(zhì)保存，尤其不利于原花青素保存。偏低或偏高的游離SO2均不抑制游離花色苷的氧化降解，但是不影響花色苷-單寧聚合物褪色。因此葡萄酒顏色受多種因素的影響。

乙醛作為鍵橋能使微氧促進(jìn)花青素與兒茶酚或單寧聚合[34]，降低單寧含量，避免SO2使花色苷脫色。微氧使乙醇和糖與花色苷反應(yīng)，降低葡萄酒中總酚和游離花色素苷含量，提高酚類(lèi)物質(zhì)和顏色的穩(wěn)定性[35]。研究發(fā)現(xiàn)，微氧對(duì)葡萄酒中酰化花色苷的影響強(qiáng)于游離花色苷，提高了葡萄酒穩(wěn)定性[36]。因此，微氧能夠通過(guò)控制游離花色苷含量明顯控制葡萄酒中花色苷的變化。舊橡木桶陳釀的葡萄酒中游離花色苷含量比新橡木桶高，而新橡木桶中聚合花色苷的含量比舊橡木桶中高[37]。因此，橡木桶自身的特性能夠調(diào)節(jié)游離花色苷和聚合花色苷在葡萄酒中的比例，控制葡萄酒中花色苷的變化。

1.3.2 內(nèi)生菌對(duì)葡萄酒顏色的影響

內(nèi)生菌具有促進(jìn)和抑制葡萄果實(shí)生長(zhǎng)的雙重作用。內(nèi)生菌能夠增加寄主對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)激耐受性、促進(jìn)寄主植物生長(zhǎng)及寄主中有效活性成分的合成[8]。葡萄皮中的內(nèi)生菌隨著葡萄酒發(fā)酵進(jìn)入葡萄酒，并長(zhǎng)期貯存在葡萄酒中。

研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉和米根霉發(fā)酵可以提高總黃酮含量[38]，而蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶對(duì)葡萄皮中總花色苷浸出率影響不顯著，纖維素酶對(duì)綠原酸浸出率效果最好，蝸牛酶對(duì)白藜蘆醇浸出率效果最好[39]，但是對(duì)游離花色苷如二甲花翠素、花青素、兒茶素和表兒茶素等的浸出作用未見(jiàn)報(bào)道。這些酶類(lèi)都是與內(nèi)生菌有關(guān)的生物活性成分，參與葡萄酒中色素類(lèi)物質(zhì)或者相關(guān)物質(zhì)的合成、分解和轉(zhuǎn)化，因此也是葡萄酒顏色變化的重要因素。黃靜等[40]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中止后冷藏更有利于多數(shù)游離酚類(lèi)物質(zhì)的形成和提高?；诖?，應(yīng)綜合考慮各個(gè)游離酚的性質(zhì)，選擇適宜的浸漬時(shí)間和貯藏溫度，提高葡萄酒中酚類(lèi)物質(zhì)的含量，這與發(fā)酵工藝對(duì)游離酚和內(nèi)生菌之間的相互作用有關(guān)。因此，內(nèi)生菌對(duì)葡萄酒顏色的影響受多種因素的影響，研究這些因素對(duì)內(nèi)生菌的多樣性影響是目前的研究趨勢(shì)。

酚類(lèi)化合物可以通過(guò)促進(jìn)或抑制酒酒球菌的生長(zhǎng)和代謝影響二次發(fā)酵和葡萄酒的品質(zhì)[41]，酒酒球菌可以通過(guò)葡萄糖苷酶代謝花色素或者其它酚類(lèi)化合物產(chǎn)生葡萄酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)[42]。這些微生物代謝和生化反應(yīng)促進(jìn)了葡萄酒的生長(zhǎng)、成熟，也導(dǎo)致了葡萄酒的不穩(wěn)定。因此，內(nèi)生菌與酚類(lèi)物質(zhì)之間相互作用，影響葡萄酒顏色的變化。

1.4 內(nèi)生菌的鑒定及分離方法

同位素示蹤法是一種十分有效的分析和鑒定工具，應(yīng)用范圍非常廣泛，速度快、準(zhǔn)確度高，可以準(zhǔn)確跟蹤樣品中某些成分的變化。目前，主要是利用同位素質(zhì)譜儀技術(shù)示蹤果實(shí)的生長(zhǎng)狀況，鑒定葡萄酒的真假、產(chǎn)地、酒齡和物質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化?；ㄉ眨偦ㄉ蘸陀坞x花色苷）的化學(xué)性質(zhì)非常活躍，利用示蹤技術(shù)能夠準(zhǔn)確及時(shí)跟蹤研究葡萄酒顏色的變化。有人利用同位素標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌與寄主之間存在著明顯的共生關(guān)系。Fadwa等[43]用13C標(biāo)記和液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)確定了葡萄酒中多種真菌毒素，這一技術(shù)具有高度可靠性和準(zhǔn)確度，值得在內(nèi)生菌篩選和特性研究中推廣。也進(jìn)一步證實(shí)花色苷與內(nèi)生菌之間存在著密不可分的關(guān)系。

除此之外，抗藥性標(biāo)記法也成功的用于檢測(cè)內(nèi)生菌的定殖動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)目標(biāo)細(xì)菌的自發(fā)突變或誘變，篩選出抗高濃度抗生素（如利福平、鏈霉素等）的突變體，再標(biāo)記、回收、檢測(cè)。吳藹民等[44]用抗利福平法研究了內(nèi)生菌73a的定殖消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。蔡學(xué)清[45]用雙抗標(biāo)記檢測(cè)到枯草芽胞桿菌BS-2和BS-1的定殖動(dòng)態(tài)。除了抗藥性標(biāo)記法外，還有免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、熒光抗體技術(shù)、Western印跡法、基因標(biāo)記法、特異性寡核苷酸片段標(biāo)記法等也廣泛應(yīng)用于內(nèi)生菌檢測(cè)。目前，GFP使內(nèi)生菌檢測(cè)更加快捷，由于宿主生活環(huán)境多樣性以及內(nèi)生菌與宿主關(guān)系的復(fù)雜性，有關(guān)內(nèi)生菌定殖和分布的情況目前都是同時(shí)采用多種研究技術(shù)綜合分析。

2 結(jié)論

綜上所述，內(nèi)生菌的來(lái)源和種類(lèi)非常豐富。釀酒葡萄蘊(yùn)含豐富的內(nèi)生菌資源和活性物質(zhì)。葡萄果皮、果梗中的酚類(lèi)物質(zhì)，尤其是色素類(lèi)物質(zhì)通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)移到葡萄酒中，再經(jīng)過(guò)陳釀相互轉(zhuǎn)化、合成，影響葡萄酒顏色的變化，而其中的內(nèi)生菌隨著發(fā)酵進(jìn)入葡萄酒，影響葡萄酒中與顏色有關(guān)的物質(zhì)的變化。一方面可以提高寄主抗逆性，提供有益的活性化合物，另一方面威脅了食品安全，具有雙重作用。

基于以上研究分析，內(nèi)生菌對(duì)葡萄酒的顏色有非常重要的影響，具有廣泛的研究?jī)r(jià)值，非常有必要開(kāi)展關(guān)于葡萄酒中內(nèi)生菌的篩選、鑒定、多樣性及對(duì)葡萄酒顏色影響機(jī)理的研究。

3 展望

葡萄酒作為一種世界性的特殊飲料食品，其品質(zhì)的優(yōu)劣影響到消費(fèi)者的喜好，其安全性影響到消費(fèi)者的身心健康和葡萄酒的推廣。顏色作為葡萄酒品質(zhì)的一個(gè)重要參考指標(biāo)，不但影響到消費(fèi)者的感官評(píng)定，而且其酚類(lèi)成分自聚或與其它物質(zhì)結(jié)合發(fā)生轉(zhuǎn)化，影響葡萄酒的品質(zhì)。只有顏色穩(wěn)定的葡萄酒才是安全的，其品質(zhì)才能得到保障。目前對(duì)于葡萄酒顏色的科學(xué)研究主要集中在利用內(nèi)生菌調(diào)節(jié)葡萄在生長(zhǎng)期間色素類(lèi)物質(zhì)的變化，采取各種措施獲得澄清的葡萄酒，提高和穩(wěn)定葡萄酒中的色素類(lèi)及與色素類(lèi)物質(zhì)變化有關(guān)的酚類(lèi)、香氣物質(zhì)、pH值和酒度等成分含量方面，及控制酵母菌、細(xì)菌、乳酸菌和醋酸菌等內(nèi)生菌群體數(shù)量（這方面研究絕大多數(shù)集中在篩選和鑒定上，進(jìn)一步的研究非常缺乏），這些成分和內(nèi)生菌往往具有雙重作用，并且也沒(méi)有更詳細(xì)的理論研究。除此之外，聚合、分解、化合或轉(zhuǎn)化等作用導(dǎo)致了葡萄酒各成分之間的不平衡——直觀地體現(xiàn)在葡萄酒的顏色、香氣和口感之間的不平衡。大量事實(shí)證明，內(nèi)生菌使生物轉(zhuǎn)化復(fù)雜化，是聚合、分解、化合或轉(zhuǎn)化等作用的推動(dòng)力，這加劇了葡萄酒顏色的變化。我國(guó)各葡萄酒產(chǎn)區(qū)生態(tài)特點(diǎn)獨(dú)特，內(nèi)生菌菌群復(fù)雜多樣，引起了葡萄酒顏色豐富多變的同時(shí)，也引起了葡萄酒其它風(fēng)味成分的變化。因此，顏色的變化會(huì)帶動(dòng)葡萄酒整體結(jié)構(gòu)和成分的改變?；诖?，需要借助科學(xué)手段探索引起葡萄酒顏色變化的根源及其機(jī)制，有助于我們因地制宜地采取科學(xué)措施穩(wěn)定葡萄酒顏色，保障葡萄酒的品質(zhì)與安全。因此，對(duì)于葡萄酒顏色變化的研究具有顯著的科學(xué)和實(shí)踐意義，對(duì)其質(zhì)量與安全的評(píng)價(jià)是未來(lái)科學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

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