氨基甲酸乙酯的研究進(jìn)展

洪 冰， 胡婷婷， 鄭婷婷， 黃國(guó)忠， 李 敏， 張 曼

（1. 鄭州市糧食科學(xué)研究所，河南鄭州 450000；2. 上海旺旺食品集團(tuán)有限公司，上海 200000）

氨基甲酸乙酯（又名尿烷、烏來坦、胺甲酸乙酯等），英文名Ethyl carbamate，是由氨基甲酸形成的一種酯。其分子量89.1，為無色無味晶體；沸點(diǎn)182～184 ℃， 熔點(diǎn) 48～50 ℃； 相對(duì)密度 1.1， 于 25 ℃下的蒸汽壓力為48 Pa，燃燒點(diǎn)為92 ℃。氨基甲酸乙酯是一種強(qiáng)致癌物且不易揮發(fā)[1]。主要商業(yè)用途是生產(chǎn)農(nóng)藥，尤其是在殺蟲劑中應(yīng)用較多。

1 氨基甲酸乙酯的來源

氨基甲酸乙酯天然存在于發(fā)酵食品中，如酸牛奶、乳酪、黃酒、葡萄酒等，是發(fā)酵過程的伴隨產(chǎn)物，具有潛在的致癌作用，并且乙醇對(duì)氨基甲酸乙酯的致癌性有促進(jìn)作用[2]。多種化合物均可與乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯，研究發(fā)現(xiàn)的有尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸、焦碳酸二乙酯和氰化物等。1943年Nettleship證實(shí)氨基甲酸乙酯會(huì)導(dǎo)致皮膚癌、淋巴癌和肝癌等疾病，是一種多位點(diǎn)致癌物[3]，會(huì)進(jìn)一步影響人體免疫系統(tǒng)。在國(guó)外，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織并制定了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定氨基甲酸乙酯含量不得超過20 μg/L[4]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)也把氨基甲酸乙酯的分類由第2B組（或可能令人類患癌的物質(zhì)） 改為第2A組（可能令人類患癌的物質(zhì)）[5]。而我國(guó)并沒有引起足夠的重視，目前尚未制定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的限量標(biāo)準(zhǔn)[6]。由于我國(guó)發(fā)酵類食品眾多，而氨基甲酸乙酯的污染又時(shí)有發(fā)生，所以隨著人們生活水平的提高，對(duì)這方面的認(rèn)識(shí)也會(huì)有所提高。

2 氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理

由于原料的復(fù)雜性和微生物菌種的多樣性，在食品發(fā)酵和貯藏過程中，氨基甲酸乙酯的形成方式也是多種多樣。

加拿大、美國(guó)、捷克等國(guó)家分別對(duì)葡萄酒中氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)做出的限定，分別為30，15，30 μg/L[3]。葡萄酒中氨基甲酸乙酯是乙醇和尿素、瓜氨酸等氨甲酰類物質(zhì)自發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生的，通過蘋果酸-乳酸菌的精氨酸脫亞氨基酶途徑（即ADI 途徑） 和酵母的尿素循環(huán)途徑代謝可以形成尿素和瓜氨酸，其含量與葡萄汁或葡萄酒中精氨酸含量、發(fā)酵溫度、pH值和菌種性能等密切相關(guān)[7]。梁萌萌等人[8]研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒生產(chǎn)的主要工藝參數(shù)中，酵母是一個(gè)重要的影響因素，酵母種類的不同會(huì)使氨基甲酸乙酯的含量有明顯的差異。精氨酸含量的提高會(huì)導(dǎo)致氨基甲酸乙酯的含量上升。乳酸菌接種量的提高不會(huì)明顯提高氨基甲酸乙酯的產(chǎn)量，但不同種類的乳酸菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯的能力不同，也會(huì)對(duì)其含量有一定影響。但是，目前關(guān)于葡萄酒中氨基甲酸乙酯合成的主要路徑還缺乏相關(guān)研究[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，水果白蘭地在發(fā)酵、蒸餾和陳釀階段氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理是不同的。在發(fā)酵階段，果汁中的精氨酸經(jīng)過酵母菌的發(fā)酵形成尿素，尿素與乙醇進(jìn)一步反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯，而且隨著發(fā)酵溫度的升高，氨基甲酸乙酯形成速度將加快[10]。氨基甲酸乙酯形成的另一種途徑是通過氫氰酸陰離子形成。氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)氫氰酸氧化形成氰酸或異氰酸，進(jìn)而與乙醇反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯[11]。在蒸餾階段，氰酸和異氰酸等前體物質(zhì)可與乙醇形成多種中間體，如氨基甲酸或氰酸乙酯，最終形成氨基甲酸乙酯，并以氣溶膠的形式進(jìn)行傳輸。在蒸餾階段，EC含量隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低[12]，因此可以通過適時(shí)的掐去酒尾，減少酒中的EC含量。在陳釀階段，白蘭地中EC的形成主要是EC前體物質(zhì)通過金屬離子的催化作用和光化學(xué)途徑，發(fā)生氧化，再與乙醇發(fā)生酯化形成EC[13-14]。

3 氨基甲酸乙酯的毒性及其機(jī)理

研究發(fā)現(xiàn)，EC在生物體內(nèi)的代謝與細(xì)胞色素P450有著緊密的聯(lián)系，并主要通過3種途徑代謝：一是P450將一小部分EC氧化為乙烯基-氨基-甲酸乙酯，在一定條件下形成乙烯基-氨基-甲酸乙酯環(huán)氧化物，并進(jìn)一步合成DNA加聚物[15]，這種加聚物可導(dǎo)致DNA雙鏈損壞并發(fā)生細(xì)胞癌變；二是90%以上的EC被肝內(nèi)的酯酶分解為乙酸、氨和碳水化合物等，還有5%左右被動(dòng)物以尿的形式排出體外；三是極少的一部分EC被P450氧化為N-羥基-氨基-甲酸乙酯，該物質(zhì)能夠誘導(dǎo)Cu2+調(diào)控的DNA損傷，這種損傷多作用于胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C） 的殘基上。具體作用機(jī)理為：在Cu2+作用下，EC被P450氧化并產(chǎn)生NO和O2-·，它們進(jìn)一步反應(yīng)生成的過氧化氮與8 - N -鳥苷酸的脫嘌呤和8 -二氫- 2' -脫氧鳥苷有密切關(guān)系。而這兩者均會(huì)誘導(dǎo)GC→TA的堿基交換，進(jìn)而導(dǎo)致基因嚴(yán)重缺失或者突變。因此，在Cu2+作用下，8 - N -鳥苷酸的脫嘌呤和8 -二氫- 2' -脫氧鳥苷的作用是EC致癌的主要機(jī)理[4，16]。

4 氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法

由于發(fā)酵食品中EC的含量都較低，且成分較繁雜，所以需要利用高精密度的儀器來完成定量檢測(cè)和分析。目前，氨基甲酸乙酯的檢測(cè)主要依靠氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS） 及其衍生法，GC-MS具有靈敏度高、選擇性好和穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，使其廣泛應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域中，但其費(fèi)用高，樣品前處理繁瑣[17]。近幾年，新增加的方法如GC-MS/MS和HPLCMS/MS，能某種程度上降低檢測(cè)限，也能進(jìn)一步簡(jiǎn)化其前處理過程[18]。OIV（International organism of vine and wine） 要求的EC檢測(cè)方法為氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）結(jié)合選擇性離子檢測(cè)器。該方法適用于氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度為10～200 μg/L時(shí)的酒精飲料[19]。除此之外，還有高效液相色譜-熒光法（HPLC-FLD）[20]，但是與GC-MS相比，其靈敏度不如GC-MS，但HPLC-FLD法操作簡(jiǎn)單，可用于生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制等。采用高分辨質(zhì)譜為基礎(chǔ)的GC-HRMS方法可以更精確地測(cè)出發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯含量[21]。有研究發(fā)現(xiàn)[22]，以硅酸鎂為載體的分離柱去除樣品中的脂肪，用更加有效的前處理方法，同樣可以提高發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯檢測(cè)精度。

周勇等人[23]利用基質(zhì)固相分散-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（MSPD-GC/MS/MS） 的測(cè)定方法對(duì)焙烤食品中的氨基甲酸乙酯進(jìn)行檢測(cè)，線性范圍為5～500 μg/L， 相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，方法檢出限2.5 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)加入 5～100 μg/kg的平均回收率為 95.40%～98.00%。結(jié)果表明，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，且具有操作簡(jiǎn)便、可靠、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于焙烤食品中的氨基甲酸乙酯檢測(cè)。

徐小民等人[24]利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS） 測(cè)定黃酒和醬油中氨基甲酸乙酯的含量。黃酒基體中氨基甲酸乙酯的加標(biāo)回收率為97.4%～98.8%, RSD為4.0%～8.4%；醬油基體中氨基甲酸乙酯的加標(biāo)回收率為96.2%～104.0%，RSD 為5.3%～10.0%。結(jié)果表明，該方法定量準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、定性確證可靠, 適用于黃酒和醬油中氨基甲酸乙酯的測(cè)定。

周瑋等人[25]用全自動(dòng)固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定酒中EC的含量，研究采用了DB-225MS型色譜柱，并采用全自動(dòng)固相萃取儀來提取物質(zhì)，使酒中微量的氨基甲酸乙酯得到了良好的分離。該方法易于掌控、提高了精密度、定量準(zhǔn)確且重復(fù)性好。由于該方法前處理稍簡(jiǎn)單，所以可以作為商檢行業(yè)的替代方法來測(cè)定市售的幾種酒類中的氨基甲酸乙酯。

劉麗斌等人[26]以乙酰膽堿酯酶對(duì)底物碘化硫代乙酰膽堿進(jìn)行水解。根據(jù)氨基甲酸乙酯對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用，測(cè)定氨基甲酸乙酯。用溴水-氫氧化鈉溶液、次氯酸鹽（如次氯酸鈉、次氯酸鈣等）、次溴酸鹽和溴、氯等鹵素單質(zhì)[27-28]處理EC后，發(fā)現(xiàn)EC對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率有了明顯提高。該方法具有所用試劑成本低、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求不高等特點(diǎn)。為進(jìn)一步開發(fā)基于酶抑制原理的酒精飲料及發(fā)酵食品中EC快速檢測(cè)方法技術(shù)及產(chǎn)品提供了理論和技術(shù)支持。

Ajtony Z等人[29]采用HPLC法對(duì)酒中的氨基甲酸乙酯含量進(jìn)行檢測(cè)，研究表明，該方法平均回收率為93.6%～103.4%。該方法靈敏度高，可用于酒類的EC檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道稱，在酒精飲料中檢測(cè)出氨基甲酸乙酯[30]。有研究采用三重四極桿質(zhì)譜儀和超聲乳化微萃取法（USAEME） 測(cè)定酒精飲料中的氨基甲酸乙酯含量。這也是第1次采用超聲乳化微萃取法測(cè)定酒精飲料中的親水性復(fù)合物[31]，具有一定的可行性。

對(duì)于企業(yè)或者監(jiān)管機(jī)構(gòu)，當(dāng)面對(duì)大量的樣品時(shí)，EC的快速檢測(cè)方法顯得尤其重要，目前EC的快速檢測(cè)方法主要有酶抑制法、薄層色譜法、光譜法和免疫檢測(cè)法等。但是目前EC快檢方法重復(fù)性較差，而且前處理的操作稍繁瑣，這些都限制了EC的快檢發(fā)展，不利于監(jiān)測(cè)發(fā)酵食品中EC含量和了解生產(chǎn)過程中EC的檢測(cè)，因此發(fā)展EC快檢方法迫在眉睫[18]。

5 氨基甲酸乙酯的控制

有研究表明[32]，對(duì)常溫存儲(chǔ)下黃酒中的氨基甲酸乙酯含量進(jìn)行6年的跟蹤檢測(cè)，結(jié)果表明隨著時(shí)間推移氨基甲酸乙酯的含量明顯上升，pH值及酸度值基本不變。長(zhǎng)期常溫儲(chǔ)存有氨基甲酸乙酯超過基準(zhǔn)值的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)氨基甲酸乙酯的控制勢(shì)在必行。

由于發(fā)酵體系多樣且復(fù)雜，直接導(dǎo)致EC的形成途徑多種多樣，因此采用單一的控制EC含量的方法顯然不可取，很難將EC全部清除。所以，要根據(jù)氨基甲酸乙酯的形成方式，建立相應(yīng)的控制方法，以降低產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯的含量。

李加友等人[33]通過氨基甲酸乙酯脫氨酶對(duì)黃酒處理，將產(chǎn)品中EC含量降低到50 μg/L以下，并且處理前后黃酒的口感無明顯變化。而且氨基甲酸乙酯脫氨酶生產(chǎn)成本較低，可以很好地進(jìn)行商業(yè)化運(yùn)用。因此氨基甲酸乙酯脫氨酶對(duì)黃酒和果酒等發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯有很好的控制作用。

林文浩等人[34]采用自主新研制的黃酒特種助劑，助劑處理的工藝條件為：添加量0.8‰～1.0‰，在室溫條件下攪拌60 min，靜置24 h后進(jìn)行過濾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯平均去除率為55.2%，尿素平均去除率為45.3%，可有效降低氨基甲酸乙酯和尿素的含量。

除此之外，還有一些根據(jù)氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理對(duì)其進(jìn)行控制的方法：一是發(fā)酵原料中尿素的控制，可對(duì)發(fā)酵的大米進(jìn)行多次淘洗，使大米中的尿素降低50%，但是同時(shí)也降低了原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，影響發(fā)酵質(zhì)量。二是工藝上的控制，如發(fā)酵溫度。有研究表明，溫度是促進(jìn)酒中EC產(chǎn)生速率的重要因素[35]。由于發(fā)酵食品的風(fēng)味受工藝條件影響較大，因此這種方法很少使用。三是利用誘變和基因工程手段選育高性能菌株，獲得使精氨酸轉(zhuǎn)化能力受阻的菌株，可有效降低氨基甲酸乙酯含量，但由于其安全性，此方法并未普及。但是，有研究發(fā)現(xiàn)[36]，在發(fā)酵食品中有效分離可消耗EC前體物質(zhì)，但同時(shí)又保證發(fā)酵風(fēng)味的菌株，并將其應(yīng)用于同種發(fā)酵食品中，可以有效降低該發(fā)酵食品中EC含量。四是脲酶對(duì)尿素的分解，我國(guó)出口黃酒均采用該方法控制氨基甲酸乙酯的含量[33]。