HPLC-MS/MS法測定桑菊感冒丸中3種成分的含量

劉世軍，孫克明，劉憲勇，張敏，谷雨，王巖，畢文超，魏瑋（.武警山東省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南25004；2.解放軍第8醫(yī)院，南京 20002）

桑菊感冒丸是源自清代名醫(yī)吳瑭的“桑菊飲”經(jīng)現(xiàn)代工藝加工而成的中成藥制劑[1]，由桑葉、菊花、連翹、薄荷素油、苦杏仁、桔梗、甘草、蘆根等八味藥組成[2-5]，臨床上多用于風(fēng)熱感冒、上呼吸道感染、流行性結(jié)膜炎、麻疹、流感等外感熱病初起，邪氣輕淺發(fā)熱不重等癥的治療。該藥療效顯著、價格實(shí)惠、副作用小，在臨床應(yīng)用非常廣泛，因此建立一個全面的標(biāo)準(zhǔn)對其質(zhì)量控制顯得尤為重要。桑菊感冒丸的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，2015年版《中國藥典》（一部）只對連翹苷的含量進(jìn)行了控制[6]；另有文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜（HPLC）-紫外分光光度法（UV）[7-10]、HPLC-蒸發(fā)光散射檢測法（ELSD）[11]等方法對類似制劑有效成分進(jìn)行檢測[8-12]。但上述各方法存在靈敏度低、分離效果不佳、專屬性差等缺點(diǎn)，用以檢測成分復(fù)雜的中成藥結(jié)果差異較大。近年來，HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）以其專屬性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢在中藥有效成分含量測定中應(yīng)用日益廣泛[13-15]。本試驗(yàn)采用HPLC-MS/MS法同時測定桑菊感冒丸中蘆丁、連翹苷、桔梗皂苷D的含量，旨在為其全面質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀-6460型三重四極桿MS儀，包括電噴霧離子源（ESI）、B.05.00 Masshunter色譜工作站（美國Agilent公司）；BP 211D型電子分析天平（德國Satorius公司，精密度：0.01 mg）；LC-600B型數(shù)控超聲波儀（濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑菊感冒丸（四川某藥廠，批號：2016041、2016042、2016043，規(guī)格：15 g/100粒）；蘆丁對照品（批號：100080-201409，純度：91.9%）、連翹苷對照品（批號：110821-201514，純度：93.5%）、桔梗皂苷D對照品（批號：111851-201406，純度：96.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Waters Atlantis C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，20%A；3～15 min，20%→60%A；15～23 min，60%A；23～24 min，60%→20%A；24～30 min，20%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；干燥氣和霧化氣：高純氮?dú)?；干燥氣溫度?70℃；干燥氣流量：25 L/min；鞘氣流量：10 L/min；毛細(xì)管電壓：4 500 V；噴嘴電壓：2 000 V；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；檢測模式：正離子；掃描時間：0.1 s。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Mass parameters

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取蘆丁、連翹苷、桔梗皂苷D對照品各10 mg，分別置于10 mL量瓶中，加60%甲醇溶液溶解并定容，即得單一對照品貯備液。精密量取上述單一對照品貯備液各2 mL，置于同一100 mL量瓶中，加60%甲醇溶液稀釋，搖勻，即得混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液1 mL，置于50 mL量瓶中，加60%甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品100粒，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：35 kHz）提取30 min，靜置至室溫，再次稱定質(zhì)量，用60%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，精密量取上清液10 mL，置于50 mL量瓶中，加60%甲醇溶液定容，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按桑菊感冒丸處方和工藝制備分別缺蘆丁、連翹苷和桔梗皂苷D的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，記錄提取離子流色譜圖，詳見圖1。結(jié)果表明，3種待測成分可被同時檢測，且陰性對照均未在各待測成分相應(yīng)出峰位置檢測到干擾成分，專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 提取離子流色譜圖Fig 1 Extraction ion chromatogram

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液0.1、0.4、2、4、10、20 mL，分別置于200 mL量瓶中，加60%甲醇溶液定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程與線性關(guān)系見表2。

表2 回歸方程與線性關(guān)系Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限。結(jié)果，蘆丁、連翹苷、桔梗皂苷D定量限分別為1.250、0.260、2.720 ng/mL，檢測限分別為 0.380、0.078、0.820 ng/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、連翹苷、桔梗皂苷D峰面積的RSD分別為1.05%、0.57%、1.00%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：2016041）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、連翹苷、桔梗皂苷D峰面積的RSD分別為1.80%、2.50%、1.20%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號：2016041）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄色譜并計(jì)算含量。結(jié)果，蘆丁、連翹苷、桔梗皂苷D含量平均值分別為260.5、184.8、169.3 μg/g，RSD分別為0.82%、1.10%、0.99%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號：2016041）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，μg/g）Tab 4Results of sample determination（n＝3，μg/g）

3 討論

3.1 流動相的選擇

在預(yù)試驗(yàn)中筆者考察了乙腈、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol/L醋酸銨溶液為流動相時的色譜圖形，結(jié)果表明，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液時可得較好的峰形和分離度。

3.2 提取方法的選擇

筆者考察了乙醇、75%乙醇溶液、100%甲醇溶液、60%甲醇溶液、20%甲醇、水為提取溶劑時的提取效果。結(jié)果表明，60%甲醇溶液提取效果最好。同時，還比較了超聲和回流提取方法的效果，結(jié)果2種方法效果相近，所以選擇較為簡單的超聲提取法。筆者也對超聲時間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，超聲30 min時效率最高，超過30 min后各成分含量趨于平穩(wěn)。

3.3 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

在對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化時，分別考察了干燥器和鞘氣的流量、毛細(xì)管電壓、噴嘴電壓等參數(shù)對含量測定的影響，最終確定文中試驗(yàn)條件為最優(yōu)條件。本試驗(yàn)采用MRM模式對樣品進(jìn)行掃描，因此母離子和子離子的確定尤為重要。在確定母離子后，選擇最佳的碎裂電壓和碰撞能量，同時將信號響應(yīng)最強(qiáng)最穩(wěn)定的子離子作為定量離子，得到穩(wěn)定提取離子流色譜圖，為樣品的定量提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于桑菊感冒丸中蘆丁、連翹苷和桔梗皂苷D含量的同時測定。

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