HPLC法同時(shí)測(cè)定附子理中丸（濃縮丸）中甘草苷和甘草酸的含量

方東偉，彭佳慶（鄂州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北鄂州 436000）

附子理中丸（濃縮丸）是由附子（制）、黨參、白術(shù)（炒）、干姜、甘草五味中藥制成的濃縮丸劑，具有溫中健脾的功效，可用于脾胃虛寒、脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、手足不溫等的治療[1-4]。該制劑收載于我國(guó)《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（第7冊(cè)）[5]，該標(biāo)準(zhǔn)中無含量測(cè)定項(xiàng)，且目前尚未有同時(shí)測(cè)定附子理中丸（濃縮丸）中甘草苷和甘草酸含量的報(bào)道。鑒于此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定該制劑中甘草苷和甘草酸含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀，包括SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A檢測(cè)器、LC-Solution工作站（日本Shimadzu公司）；LC-350A型超聲波處理器（濟(jì)寧市魯超儀器有限公司）；BS21S型、BS210S型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）

1.2 藥品與試劑

附子理中丸（濃縮丸）（河南宛西制藥股份有限公司，批號(hào)：140601；蘭州佛慈溪制藥股份有限公司，批號(hào)：14M39；蘭州太寶制藥有限公司，批號(hào)：81150110；蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1505111；馬鞍山天?？邓帢I(yè)有限公司，批號(hào)：201410022；陜西天洋制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20140304；規(guī)格：每8丸相當(dāng)于原生藥3 g）；甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-201005，純度：94.9%）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-201116，純度：93.1%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～35 min，19%→50%A；35～36 min，50%→100%A；36～40 min，100%→19%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取甘草苷對(duì)照品4.84 mg，甘草酸銨對(duì)照品7.18 mg（甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨的質(zhì)量/1.020 7，即約為7.03 mg），置于同一50 mL量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品粉末0.5 g，置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶液適量，超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz，下同）處理30 min，冷卻至室溫，加70%乙醇溶液定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例制備缺甘草的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以甘草苷峰計(jì)≥5 000，保留時(shí)間為14.7 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、3、4、6、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以甘草苷和甘草酸質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得甘草苷回歸方程為y＝16 475x－73 589（r＝0.999 1）、甘草酸回歸方程為y＝3 107.9x－19 221（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，甘草苷和甘草酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.68～96.8、14.08～140.8μg/mL。

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD。結(jié)果，甘草苷和甘草酸的LOQ分別為0.2、0.3μg/mL，LOD分別為0.1、0.01μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.85%、1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：140601）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.21%、0.22%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：140601）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，甘草苷和甘草酸含量的平均值分別為2.65、6.80 mg/g，RSD分別為0.94%、0.39%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：140601）適量，共9份，每份約0.2 g，分別置于10 mL量瓶中，各加入低、中、高質(zhì)量的甘草苷和甘草酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測(cè)定

取6批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

筆者曾考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)的色譜情況，結(jié)果以甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，甘草苷、甘草酸峰與干擾峰不能有效分離，而采用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，洗脫時(shí)間適宜，各峰分離較好。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相。

3.2 超聲提取時(shí)間的選擇

筆者考察了超聲處理時(shí)間（10、20、30、40 min）對(duì)樣品提取率的影響。結(jié)果，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的提取率增加，但是超聲處理30 min和40 min時(shí)的樣品提取率基本一致，為節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，本試驗(yàn)選擇超聲處理時(shí)間為30 min。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于附子理中丸（濃縮丸）中甘草苷和甘草酸含量的同時(shí)測(cè)定。

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