雞毒支原體河南株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

徐引弟　焦文強　王治方　李海利　張青嫻　朱文豪　王克領(lǐng)

摘要：為確診2017年4月引起河南省許昌市某蛋雞場蛋雞發(fā)生呼吸道、關(guān)節(jié)疾病的病原，采集發(fā)生呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大蛋雞的肺、氣管、關(guān)節(jié)液共21份病料，通過病原分離培養(yǎng)、16S rRNA 基因序列測定比對，確定病原為雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG），共分離鑒定12株雞毒支原體。對其中分離自肺的毒株HNMga1進行16S rRNA序列分析、動物試驗和藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)該菌對雞具有較強毒力，對大觀霉素、環(huán)丙沙星、左氟沙星、林可霉素、氟苯尼考、乙酰螺旋霉素、克林霉素最為敏感。本研究為下一步研制雞毒支原體的診斷試劑和篩選疫苗毒株打下基礎(chǔ)，同時為雞毒支原體病的診斷和防治提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞毒支原體；分離鑒定；毒力；藥敏試驗

中圖分類號：S858.31 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0124-05

Abstract In order to confirm the cause of respiratory and articular diseases in a laying hen farm in Xuchang City， Henan Province， 21 samples containing lungs， tracheas and joint fluid of laying hens with dyspnea and arthrocele were collected in April 2017. The pathogen was identified as Mycoplasma gallisepticum by pathogen isolation and culture， 16S rRNA gene sequencing and blasting. Twelve strains of Mycoplasma gallisepticum were isolated and identified. The HNMga1 strain isolated from lung was analyzed by 16S rRNA sequence analysis， animal test and drug sensitivity test. The isolate was virulent to hens and most sensitive to spectinomycin， ciprofloxacin， levofloxacin， lincomycin， florfenicol， acetylspiramycin and clindamycin. It would lay a foundation for the further development of diagnostic reagent for Mycoplasma gallisepticum and the screening of vaccine strains， and also provide the bases for the diagnosis and control of Mycoplasma gallisepticum.

Keywords Mycoplasma gallisepticum； Isolation and identification； Virulence； Drug sensitive test

雞毒支原體又稱雞敗血支原體，是引起雞和火雞等多種禽類慢性呼吸道?。╟hronic respiratory disease，CRD）或火雞傳染性竇炎的病原，其特征為咳嗽、流鼻涕、呼吸道啰音和張口呼吸。該病原體存在于病雞和帶菌雞的呼吸道、卵巢、輸卵管和精液中，帶菌雞胚可垂直傳遞給后代，公雞可通過交配將病傳遍全群。雞群一旦染病即難以徹底根除。雛雞比成年雞易感，成年雞常無明顯癥狀，應(yīng)激因子及其它呼吸道病原微生物、新城疫弱毒株、大腸桿菌等繼發(fā)感染或協(xié)同作用，使病情惡化、癥狀明顯。發(fā)病率與死亡率的高低，除與日齡和菌株有關(guān)外，與并發(fā)感染、飼養(yǎng)管理、衛(wèi)生條件以及應(yīng)激等也有關(guān)系。該病發(fā)病率一般為30%～40%，高者可達80%以上；死亡率1%～10%，高者可達20%～50%[1-3]。

隨著人們長期用藥不規(guī)范，使得MG對泰樂菌素、替米考星等藥物產(chǎn)生可遺傳耐藥性[4-6]。目前疫苗免疫是預(yù)防MG感染的最主要手段，滅活疫苗具有安全、穩(wěn)定和易保存等優(yōu)點，解決了MG 感染帶來的產(chǎn)蛋率下降問題。然而疫苗使用雖然降低了 MG 排放量從而減輕CRD 癥狀，但不能抑制 MG 的水平傳播。弱毒疫苗是目前用于預(yù)防CRD的主流疫苗，具有免疫反應(yīng)快、用量少等優(yōu)點[7-10]。鑒于此，本試驗從河南省許昌市某蛋雞場發(fā)生鼻竇炎、呼吸困難致死的產(chǎn)蛋雞肺臟中分離鑒定雞毒支原體，為雞慢性呼吸道病的診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源與毒株

2017年4月，河南省許昌市某蛋雞場蛋雞發(fā)生鼻竇炎、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大、跛行等癥狀，具體表現(xiàn)極度消瘦、產(chǎn)蛋下降、翅膀下垂、慢性零星死亡。剖檢可見眶下竇充滿漿液性、粘液性或干酪樣分泌物，氣囊渾濁、增厚，關(guān)節(jié)皮下有纖維素性分泌物。陽性對照毒株F36購自青島易邦生物工程有限公司。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

PPLO肉湯粉、胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、酵母粉、瓊脂粉，購自美國BD公司。葡萄糖、酚紅，購自上海國藥集團公司。改良eagles培養(yǎng)基（MEM）、馬血清，購自Hyclone公司。青霉素購自華北制藥集團公司。精氨酸購自Roche公司。犢牛血清、2×Taq PCR Mix、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）有限公司。

PPLO液體培養(yǎng)基的制備：PPLO肉湯粉10.5 g，葡萄糖2.5 g，酵母粉2.5 g，溶于440 mL超純水中，115℃滅菌15 min，加MEM 5 mL、馬血清50 mL、8萬單位青霉素5 mL、10%精氨酸10 mL和1% 酚紅500 μL；PPLO固體培養(yǎng)基的制備：將含1.5% 瓊脂粉的PPLO液體培養(yǎng)基（無酚紅）于115℃滅菌15 min，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

TSA固體培養(yǎng)基的制備：稱取40 g TSA溶于1 000 mL水，121℃高壓滅菌15 min。溫度下降到大約45℃時，加入50 mL犢牛血清，混勻之后傾倒無菌平皿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雞毒支原體的分離培養(yǎng)

無菌條件下分別向采集的氣管、肺組織、關(guān)節(jié)分泌物加入2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），碾磨后5 000 r/min離心3 min，上清用0.45 μm濾膜過濾于PPLO液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5 d后，液體培養(yǎng)基變黃即接種固體培養(yǎng)基，未變黃繼續(xù)傳代培養(yǎng)，肉眼觀察固體平板上是否有菌落生長，若有則在低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。同時肺、關(guān)節(jié)組織涂布TSA平板，37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h。

1.4 雞毒支原體的鑒定

1.4.1 引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank中雞毒支原體F株16S rRNA基因（Genbank No.CP001873）設(shè)計引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成，上游引物P1： 5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物P2： 5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′，預(yù)計擴增目的片段1 483 bp。

1.4.2 PCR鑒定 將疑似支原體菌落接種于PPLO液體培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，收集菌體，用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。PCR反應(yīng)體系（總體積為25 μL）：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上下游引物P1、P2各1 μL （10 μmol/L），模板DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR循環(huán)體系：95℃ 5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。取10 μL擴增產(chǎn)物進行電泳，觀察結(jié)果。陽性結(jié)果進行測序并用Blast比對序列。

1.4.3 16S rRNA基因的序列分析 將分離自肺的雞毒支原體菌株命名為HNMga1，于2017年6月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC No：13857。用DNA Star軟件對HNMga1的16S rRNA基因進行分析并繪制系統(tǒng)進化樹。

1.5 動物試驗

選45日齡健康雞20只，均為雞毒支原體ELISA抗體陰性。試驗雞隨機分為兩組，對照組和試驗組各10只。將HNMga1接種于PPLO液體培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，測定菌體濃度，連續(xù)10倍稀釋涂布固體平板，低倍鏡下活菌計數(shù)并計算培養(yǎng)物原液菌體濃度，調(diào)整菌體濃度至107 CFU/mL，試驗組動物通過喉氣管接種1 mL HNMga1，對照組動物通過喉氣管接種1 mL滅菌的PPLO液體培養(yǎng)基。試驗期為15 d，每天觀察試驗動物臨床表現(xiàn)，如試驗動物死亡則立即進行剖殺，觀察呼吸道病變并采集病料。于15 d試驗結(jié)束時，剖殺所有試驗動物。

1.6 藥敏試驗

利用藥敏紙片法對分離的HNMga1進行藥敏感試驗，將HNMga1接種于PPLO液體培養(yǎng)3 d后，測定菌體濃度，涂布PPLO固體平板并貼藥敏紙片于平板中央，所用藥敏試紙種類如下：環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氟沙星、加替沙星、林可霉素、氟苯尼考、氯霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、大觀霉素、乙酰螺旋霉素、克林霉素、阿奇霉素、依諾沙星、克拉霉素、妥布霉素。3 d后根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞毒支原體的分離培養(yǎng)

氣管、肺、關(guān)節(jié)液碾磨上清過濾后，接種固體培養(yǎng)基5 ～ 10 d，其中1個氣管、2個肺、9個關(guān)節(jié)液上清所涂平板陸續(xù)肉眼見極小的圓形、光滑、透明、露珠狀菌落。低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈圓形，菌落中央有顏色較深且致密的乳頭狀突起，典型的“煎荷包蛋樣”（圖1）。吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體為多形態(tài)，呈球形、卵圓形、彎曲的絲狀、螺旋狀（圖2）。TSA平板上未有細菌生長。

2.2 雞毒支原體的鑒定

將12株疑似分離菌進行PCR擴增，結(jié)果如圖3，引物P1、P2擴增出符合預(yù)期大小片段，經(jīng)測序，與雞毒支原體ATCC15319 （Genbank No. JN935884）、B3443-15-3-60 （Genbank No. MF196180）、NBRC14859 （Genbank No. NR_113687）、B2 （Genbank No. FJ666137）、PG16 （Genbank No. NR_044638）同源性均在98.5%以上，與鴿支原體FG295 （Genbank No.EU859979）、MMP-1 （Genbank No. NR_025063） 及其它支原體同源性均低于93%。12株分離菌之間序列一致，證明分離的毒株均為同一毒株，即雞毒支原體。

2.3 16S rRNA基因的序列分析

用DNA Star軟件中的MegAlign對HNMga1的16S rRNA 基因的核苷酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，如圖4，雞毒支原體16S rRNA 基因分成3個群，HNMga1的16S rRNA 基因與ATCC15319、B2、B293-15-7-347、B3443-15-3-60、B878-14-M3、B878-14-M2_131、NBRC14859、PG16同源性最近，在同一個群，與A5969、NBRC14855、ABAB1999、ATCC19610、MG-V25-2、PG31、R、S6同源性稍遠，而與疫苗株F同源性較遠，F(xiàn)株單獨在一群。

2.4 動物試驗結(jié)果

試驗組動物在接種支原體5 d后陸續(xù)表現(xiàn)出不同程度的臨床癥狀：精神不振、流涕、咳嗽、喘氣、張口呼吸、頭部腫脹，7 d后死亡1只，10 d后死亡2只。發(fā)病率100%，死亡率30%。對照組動物在試驗期間無臨床癥狀。試驗結(jié)束后剖殺試驗組和對照組動物，采集病料，進行支原體分離。試驗組出現(xiàn)不同程度的鼻竇炎、氣囊炎，眶下竇充滿灰白色漿液性、粘性分泌物，氣囊不同程度混濁。對照組剖檢均未發(fā)生明顯病理變化，且病料均未分離到支原體，試驗組的10份病料中均分離到雞毒支原體，菌落形態(tài)、PCR鑒定結(jié)果與HNMga1一致。

2.5 藥敏試驗

由表1可知，HNMga1對大觀霉素、環(huán)丙沙星、左氟沙星、林可霉素、氟苯尼考、乙酰螺旋霉素、克林霉素最敏感，其次為四環(huán)素、諾氟沙星、氯霉素、加替沙星，對阿奇霉素、鏈霉素、妥布霉素、依諾沙星、多西環(huán)素、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、克拉霉素表現(xiàn)耐藥。

3 討論與結(jié)論

本試驗從發(fā)生呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹蛋雞的肺、氣管、關(guān)節(jié)中經(jīng)過固體培養(yǎng)、鏡檢染色、PCR鑒定，分離出12株雞毒支原體菌株，對分離自肺的毒株HNMga1進行16S rRNA基因序列分析、動物試驗和藥敏試驗，為下一步研制雞毒支原體診斷試劑和篩選疫苗毒株打下基礎(chǔ)，同時為慢性呼吸道病的診斷和防治提供依據(jù)。

MG近年來對世界各國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，1933年Nelson[11]首次從感染雞群中分離出該病原體，隨后廣泛迅速傳播，成世界性流行病。1976年哈爾濱獸醫(yī)研究所從患有慢性呼吸道病雞群中分離到MG，隨后1984年畢丁仁等[12]首次從北京和南京分離到61株支原體，之后在全國迅速傳播。我國雞群MG陽性感染率已達50% ～ 80%[13-17]。MG的傳播主要經(jīng)過水平和垂直傳播，造成MG代代相傳、疾病不斷流行，難以根除。疫苗免疫是防治MG的主要措施，主要有滅活苗和弱毒苗，滅活苗可產(chǎn)生較好的免疫力，但需時長、接種劑量大、接種次數(shù)多，不能通過滴鼻點眼方式刺激粘膜免疫；弱毒苗可以快速刺激機體產(chǎn)生粘膜免疫，但是受母源抗體干擾，存在散毒風(fēng)險[7-10]。因此，任何一種疫苗都無法提供完全的免疫。抗生素藥物包括大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類等，對MG都有一定的療效，但效果不理想。MG存在于纖毛尖部，藥物難以到達，使得支原體難以根除，長期使用，造成藥物殘留，極易產(chǎn)生耐藥性[18-26]。

本試驗中蛋雞場長期受MG的困擾，蛋雞呼吸困難、生長緩慢、產(chǎn)蛋率下降、零星死亡，盡管使用疫苗免疫和藥物也不能有效控制MG感染，從氣管、肺、關(guān)節(jié)中仍分離到高毒力MG，盡管體外藥敏試驗結(jié)果顯示對部分藥物敏感，但臨床使用效果不理想，因此MG的防控不僅需要疫苗防疫和藥物治療，更需要包括加強生物安全、飼養(yǎng)管理、種雞、雞蛋及公雞的凈化等綜合措施。

參 考 文 獻：

[1] 雷元元， 何生虎， 王靜， 等. 雞毒支原體病研究進展[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究， 2014， 35（3）： 39-42.

[2] 王育偉， 岳華， 張曉暉， 等. 雞毒支原體研究概況[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展， 2016， 37（7）： 106-110.

[3] Ley D H，Hawley D M，Geary S J， et al. House finch （Haemorhous mexicanus） conjunctivitis， and Mycoplasma spp. isolated from North American wild birds， 1994—2015[J]. J. Wildlife Dis.，2016， 52（3）： 669-673.

[4] 孔意端， 林居純， 陳繼榮， 等. 雞毒支原體不同地區(qū)分離株對常用抗菌藥物的敏感性試驗[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展， 2008， 29（6）： 35-38.

[5] Nhung N T，Chansiripornchai N，Carrique-Mas J J. Antimicrobial resistance in bacterial poultry pathogens： a review[J]. Front. Vet. Sci.， 2017， 4（126）： 1-17.

[6] Zhang N，Ye X，Wu Y， et al. Determination of the mutant selection window and evaluation of the killing of Mycoplasma gallisepticum by danofloxacin， doxycycline， tilmicosin， tylvalosin and valnemulin[J]. PLoS One， 2017， 12（1）：e0169134.

[7] 丁亮. 雞毒支原體F弱毒疫苗對肉雞生長及免疫性能影響的研究[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[8] 劉軍軍， 丁亮， 魏建忠， 等. F株雞毒支原體疫苗對肉雞生產(chǎn)性能的影響[J]. 中國生物制品學(xué)雜志， 2014， 27（1）： 13-l8.

[9] 吳清民， 裴建武， 王素英， 等. 雞毒支原體油乳劑滅活苗和弱毒苗的免疫效力測定[J]. 中國獸醫(yī)雜志， 2001， 37（4）： 40-41.

[10]Machado L D S，Santos F，Togashi C K， et al. Egg quality in laying hens exposed to Mycoplasma gallisepticum F-strain attenuated vaccine[J]. Poultry Sci.， 2017， 96（4）： 976-979.

[11]Nelson J B. Studies on an uncomplicated coryza of the domestic foul： II.The relation of the "bacillary" coryza to that produced by exudates[J]. Exp. Med.， 1933， 58（3）： 297-304.

[12]畢丁仁. 研究報告會輯[M].北京：中國獸藥監(jiān)察所， 1984： 55-76.

[13]遲靈芝， 隋兆峰， 王洪利， 等. 濰坊地區(qū)雞毒支原體的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國家禽， 2017， 39（14）： 77-80.

[14]圈華， 韓志輝. 青海省西寧地區(qū)雞毒支原體感染的血清學(xué)檢測[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展， 2010， 31（9）： 126-127.

[15]黃招玲， 潘書磊. 福建部分地區(qū)規(guī)?；u場雞毒支原體感染血清學(xué)調(diào)查[J]. 福建畜牧獸醫(yī)， 2013， 35（6）： 14-15.

[16]孟冬霞， 賀東昌， 武果桃， 等. 山西省雞毒支原體感染血清學(xué)調(diào)查[J]. 中國獸醫(yī)雜志， 2011， 47（8）： 45-47.

[17]孔意端， 陳峰， 廖理克， 等. 廣東地區(qū)雞毒支原體血清學(xué)調(diào)查[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技， 2010， 35（1）： 21-23.

[18]齊新永， 張維誼， 徐鋒， 等. 上海地區(qū)雞毒支原體感染抗體的血清學(xué)調(diào)查[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2014（3）： 52-53.

[19]吳清民， 楊秀玉， 沈志強， 等. 雞毒支原體的分離鑒定和最低抑菌濃度測定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報， 2003， 25（4）： 309-312.

[20]郤翠仙， 朱天樂， 陳合適. 雞毒支原體的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2011， 38（2）： 172-174.

[21]范建華， 何友義， 韋玉勇， 等. 磷酸替米考星可溶性粉對人工感染雞毒支原體的療效試驗[J]. 中國獸藥雜志， 2014， 48（6）： 58-61.

[22]隋兆峰， 張侃吉， 徐建義， 等. 山東地區(qū)雞毒支原體分離鑒定及耐藥性監(jiān)測[J]. 中國家禽， 2016， 38（14）： 51-54.

[23]Garmyn A，Vereecken M，Degussem K， et al. Efficacy of tiamulin alone or in combination with chlortetracycline against experimental Mycoplasma gallisepticum infection in chickens[J]. Poultry Sci.， 2017， 96（9）： 3367-3374.

[24]Xiao X，Sun J，Yang T， et al. Pharmacokinetic/Pharmacodynamic profiles of tiamulin in an experimental intratracheal infection model of Mycoplasma gallisepticum[J]. Front. Vet. Sci.，2016， 3（75）： 1-8.

[25]Zhao Y，Cheng G，Hao H， et al. In vitro antimicrobial activities of animal-used quinoxaline 1， 4-di-N-oxides against mycobacteria，mycoplasma and fungi[J]. BMC Vet. Res.， 2016， 12（1）： 186.

[26]Zhang N，Gu X，Ye X， et al. The PK/PD interactions of doxycycline against Mycoplasma gallisepticum[J]. Front. Microbiol.， 2016， 7： 653.