HPLC法用于止血養(yǎng)元口服液中蒙花苷和人參皂苷Rg1的含量測定

胡北 趙慶春 張朝紳 吳瓊 馬宏達(dá)

[摘要] 目的 建立止血養(yǎng)元口服液中蒙花苷和人參皂苷Rg1含量的高效液相色譜（HPLC）測定方法。 方法 采用HPLC對小薊中蒙花苷和人參中人參皂苷Rg1進(jìn)行含量測定。小薊中蒙花苷的含量測定：流動(dòng)相為甲醇-0.5%醋酸溶液（50∶50），檢測波長為326 nm。人參中人參皂苷Rg1的含量測定：流動(dòng)相為乙腈-水（20∶80），檢測波長為203 nm。 結(jié)果 蒙花苷在5～160 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.9997），平均加樣回收率為97.73%，RSD = 2.01%（n = 6）。人參皂苷Rg1在0.025～0.8 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.9998），平均加樣回收率為98.62%，RSD = 2.48%（n = 6）；3批樣品含量測定結(jié)果均符合要求。 結(jié)論 本研究所用含量測定方法簡單準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，能有效控制止血養(yǎng)元口服液的藥品質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 止血養(yǎng)元口服液；蒙花苷；人參皂苷Rg1

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（c）-0102-05

[Abstract] Objective To establish high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the content determination of buddleoside and ginsenoside Rg1 in Zhixue Yangyuan Oral Liquid. Methods HPLC was used to determine the content of buddleoside in Herba Cirsii and ginsenoside Rg1 in Radix Ginseng. The content of buddleoside in Herba Cirsii was determinated with mobile phase consisted of methanol-0.5% acetic acid water （50∶50）. The detection wavelength was set at 326 nm. The content of ginsenoside Rg1 in Radix Ginseng was determinated with mobile phase consisted of acetonitrile-water （20∶80）. The detection wavelength was set at 203 nm. Results There was a good linear relationship between buddleoside and peak area in the range of 5-160 μg/mL （r = 0.9997） with an average recovery of 97.73%， RSD = 2.01% （n = 6）. There was a good linear relationship between ginsenoside Rg1 and peak area in the range of 0.025-0.8 mg/mL （r = 0.9998） with an average recovery of 98.62%， RSD = 2.48% （n = 6）. The content determination results of the three batches of samples all met the requirements. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It is effective in controlling the quality of Zhixue Yangyuan Oral Liquid.

[Key words] Zhixue Yangyuan Oral Liquid； Buddleoside； Ginsenoside Rg1

止血養(yǎng)元口服液是沈陽軍區(qū)總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）自主開發(fā)的一個(gè)院內(nèi)制劑品種，已經(jīng)在我院臨床科室使用多年，患者反映較好，本制劑由人參、小薊、蒲黃、熟地黃、烏梅、川芎、紫珠葉7味中藥組成，主要用于男子或婦人血熱妄行、吐血、衄血、嘔血、咯血等各種對應(yīng)證候的出血。小薊和人參為方中君藥。本研究采用高效液相色譜法對小薊中蒙花苷和人參中人參皂苷Rg1進(jìn)行含量測定，并建立其方法，以期能更有效地控制止血養(yǎng)元口服液的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Thermo公司，U3000）；紫外-可見分光光度計(jì)（島津公司，UV-1700）；電子分析天平（島津公司，AUW 120D型，百萬分之一）。

1.2 試藥與試劑

蒙花苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：111528-201509）；人參皂苷Rg1對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110703-201128）；止血養(yǎng)元口服液（我院院內(nèi)制劑，批號：20170207、20170315、20170320）；乙腈、甲醇（Sigma公司，色譜純），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 小薊中蒙花苷的測定

2.1.1 色譜條件 填充劑采用十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：甲醇-0.5%醋酸溶液（50∶50）；檢測波長：326 nm[1-3]。理論塔板數(shù)按蒙花苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.1.2 對照品溶液的配制 稱取適量蒙花苷對照品，精密稱定，加甲醇超聲使其溶解[4-7]，制成20 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取本品2 mL，置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 制備陰性對照溶液 取按處方除去小薊的陰性樣品2 mL，按照上述方法進(jìn)行配制。

2.1.5 專屬性考察 分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜儀，結(jié)果表明，陰性對照不干擾蒙花苷的測定，且其分離度均大于1.5，符合要求，表明此方法的專屬性較強(qiáng)。見圖1。

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL的蒙花苷對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1.1”所述條件進(jìn)行分析，以蒙花苷對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：y = 110 86 x - 282 17，r = 0.9997。結(jié)果顯示，蒙花苷對照品在5～160 μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取5 μL蒙花苷對照品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄蒙花苷對照品的峰面積，其RSD為1.52%（n = 6），符合要求。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密量取2 mL，按照“2.1.1”所述的供試品溶液制備操作，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，分別在0、2、4、6、8、10、12 h，測定樣品中蒙花苷的峰面積，測得其峰面積值的RSD為2.51%（n = 6），表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密量取2 mL（共6份），按照上述供試品溶液配制方法操作，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，然后測得每份樣品中蒙花苷的含量[8-9]。結(jié)果樣品中蒙花苷的平均含量為0.2034 mg/mL，RSD為2.80%（n = 6），符合要求。

2.1.10 回收率試驗(yàn) 取同一批樣品，精密量取1 mL（共6份），分別加入蒙花苷對照品溶液（0.114 66 mg/mL）各2 mL，再按“2.1.3”配制供試品溶液，制成回收率試驗(yàn)所用樣品[10-11]，按照“2.1.1”所述色譜條件進(jìn)行分析，測定樣品中蒙花苷的含量，并計(jì)算其回收率，其平均回收率為97.73%，RSD為2.013%（n = 6），符合要求。結(jié)果見表1。

2.1.11 樣品測定 取3個(gè)批號的止血養(yǎng)元口服液樣品，按照“2.1.3”所述的供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，按照“2.1.1”所述色譜條件進(jìn)行分析，測定每批樣品中蒙花苷的含量，分別為0.2605 mg/mL（批號：20170207）、0.2052 mg/mL（批號：20170315）、0.2036 mg/mL（批號：20170320）。

2.2 人參中人參皂苷Rg1的含量測定

2.2.1 人參皂苷Rg1的含量測定色譜條件 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：乙腈-水（20∶80）；檢測波長：203 nm[12-16]。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2.2 制備對照品溶液 精密稱定人參皂苷Rg1對照品，加適量乙腈超聲使其溶解，制成0.12 mg/mL的溶液。

2.2.3 制備供試品溶液 精密量取本品25 mL，加三氯甲烷振搖提取3次，每次25 mL，棄去三氯甲烷提取液，水液加水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，加氨試液洗滌2次，每次25 mL，棄去氨試液，再加用正丁醇飽和的水進(jìn)行振搖洗滌2次，每次用25 mL正丁醇飽和的水，之后棄去水液，然后把正丁醇液濃縮至干，最后用乙腈把剩余殘?jiān)芙?，并將殘?jiān)D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容，即得供試品溶液[17-19]。

2.2.4 制備陰性對照溶液 取按處方除去人參的陰性對照樣品25 mL，按上述方法進(jìn)行制備。

2.2.5 專屬性考察 分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1的含量測定不受陰性對照樣品的干擾，其分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)均不低于5000。結(jié)果表明，本方法的專屬性較強(qiáng)。見圖2。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液（濃度分為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL）20 μL，注入液相色譜儀，再按照“2.2.1”所述條件進(jìn)行分析，測定其峰面積，以人參皂苷Rg1濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：y = 13 851x - 73，r = 0.9998。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在0.025～0.8 mg/mL的范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取20 μL對照品溶液，按照“2.2.1”所述條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，并測得其峰面積值的RSD為1.42%（n = 6），符合要求。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密量取25 mL，按照上述供試品溶液制備操作，按上述色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8、12 h，測定樣品中人參皂苷Rg1的峰面積，其RSD為1.75%（n = 6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密量取25 mL（共6份），按照上述供試品溶液配制方法進(jìn)行操作，按照“2.2.1”所述條件進(jìn)行分析，測得每份樣品中人參皂苷Rg1的含量，其平均含量為0.0552 mg/mL，RSD為2.07%（n = 6），符合要求。

2.2.10 回收率試驗(yàn) 取同一批樣品，取12.5 mL（共6份），精密量取，分別加入人參皂苷Rg1對照品溶液（0.704 mg/mL）各1 mL，再按“2.2.3”制備供試品溶液，制成回收率試驗(yàn)用樣品[20-22]，按照“2.2.1”所述條件進(jìn)行分析，測定樣品中的含量，并計(jì)算其回收率，結(jié)果平均回收率為98.62%，其RSD為2.484%（n = 6），符合要求。見表2。

2.2.11 樣品測定 取3個(gè)批號的止血養(yǎng)元口服液樣品，按照“2.2.3”制備供試品溶液，按照“2.2.1”所述條件進(jìn)行分析，并測定樣品中人參皂苷Rg1的含量，分別為0.0396 mg/mL（批號：20170207）、0.0555 mg/mL（批號：20170315）、0.0482 mg/mL（批號：20170320）。

3 討論

蒙花苷對照品易溶于熱的甲醇溶液，故在配制蒙花苷對照品溶液的過程中，需要仔細(xì)進(jìn)行觀察，確保對照品能充分溶解，不僅需要進(jìn)行超聲輔助溶解，必要時(shí)可采用稍微加熱的方法輔助其溶解，然后使其冷卻至室溫，再稀釋至刻度。

人參中指標(biāo)性成分的含量測定，考察了3種不同的方法對人參中指標(biāo)性成分進(jìn)行提取，采用乙腈-水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，對人參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1進(jìn)行檢測，此方法干擾較大，而且其液相條件苛刻，故再換其他方法進(jìn)行考察。采用等度洗脫進(jìn)行測定人參中的指標(biāo)性成分，同時(shí)考察3種不同提取方法，在這個(gè)條件下，這3種提取方法只檢測到了人參皂苷Rg1及人參皂苷Re，未檢測到人參皂苷Rb1，但是人參皂苷Re存在陰性干擾，故只能測定人參皂苷Rg1。

綜上所述，本研究建立的HPLC法用于止血養(yǎng)元口服液中蒙花苷和人參皂苷Rg1的含量測定方法簡單可靠，重復(fù)性好，能有效控制止血養(yǎng)元口服液的藥品質(zhì)量。

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（收稿日期：2018-03-28 本文編輯：張瑜杰）