采用堿裂解法提取DNA鑒定細(xì)菌和酵母菌

遲原龍，唐垚，金璐，張鳳，姚開(kāi)，何強(qiáng)

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610041）

四川泡菜是我國(guó)西南地區(qū)主要發(fā)酵蔬菜制品之一，常被作為烹飪?cè)?、佐餐菜或調(diào)味料使用[1]。四川泡菜獨(dú)特的風(fēng)味和品質(zhì)與其中微生物作用密切相關(guān)，因此鑒定分析泡菜環(huán)境中的微生物對(duì)泡菜工藝優(yōu)化和防腐保質(zhì)具有重要意義[2-5]。菌種鑒定首先需要提取其DNA物質(zhì)，目前基于酶法破壁的試劑盒法是提取菌種DNA的常用方法，但其存在成本高、純化步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)的不足[6-7]。鑒于本文擬采用堿裂解法提取DNA對(duì)四川泡菜中分離得到的細(xì)菌和酵母菌進(jìn)行鑒定，以期建立一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與儀器

12株待測(cè)菌株分離自四川泡菜，其中包括8株細(xì)菌（菌株B1～B8）和4株酵母菌（菌株F1～F4），-20℃下保藏。

MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、真菌DNA提取試劑盒、2×PCR Mix：上海生工生物技術(shù)有限公司；PCR引物：成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DNA提取緩沖液：將0.584 g EDTA和0.1 g吐溫20溶解于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至8.0。DNA提取堿裂解液：將80 g NaOH溶解于1 L蒸餾水中，并利用聚醇類(lèi)非離子表面活性劑調(diào)節(jié)pH值至13.4。

Power Pac Basic型電泳儀、PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Gel 310型凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP公司；5427R型高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；P330型核酸蛋白儀：德國(guó)Implen公司。

1.2 基于堿裂解法提取菌株DNA

將8株細(xì)菌和4株酵母菌分別于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和麥芽汁瓊脂平板上活化，然后分別取菌齡18 h菌體10 mg于裝有200 μL DNA提取緩沖液的離心管中。以10 000 r/min離心1 min，除去上層液，加入100 μL DNA提取堿裂解液渦旋混勻，90℃水浴15 min，再以10 000 r/min離心1 min，收集上清液即為菌株DNA的提取物。采用核酸蛋白儀測(cè)試菌株DNA提取物的濃度，以及其于λ=260 nm和λ=280 nm處的吸收波長(zhǎng)A260和A280，以A260/A280表征菌株DNA提取物的純度[8]。

1.3 PCR擴(kuò)增、電泳和測(cè)序

細(xì)菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增采用正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'）和反向引物1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。反應(yīng)程序和反應(yīng)體系參照Haruta等方法進(jìn)行[9]。酵母菌的26S rDNA PCR擴(kuò)增采用正向引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和反向引物 NL4（5'-GGTCC GTGTTTCAAGACGG-3'）。反應(yīng)程序和反應(yīng)體系參照Tofalo等方法進(jìn)行[10]。

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠以120 V電泳15 min～20 min，通過(guò)比對(duì)其凝膠成像評(píng)價(jià)菌株DNA的提取效果。然后將PCR產(chǎn)物陽(yáng)性克隆送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用Sequence Scanner軟件分析測(cè)得序列的長(zhǎng)度及可信度。采用Dnaman軟件拼接雙向測(cè)序結(jié)果并與NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列同源性比對(duì)，鑒定菌株的種屬[11-12]。以試劑盒法鑒定12株待測(cè)菌株的結(jié)果作為對(duì)照，評(píng)價(jià)堿裂解法菌株鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 菌株DNA提取方法的成本和耗時(shí)分析

對(duì)采用堿裂解法和離心柱式試劑盒法提取菌株DNA的成本和耗時(shí)進(jìn)行分析。測(cè)試成本是計(jì)算完成100次菌株DNA提取所購(gòu)買(mǎi)的試劑和材料的費(fèi)用。測(cè)試耗時(shí)包括準(zhǔn)備階段和提取階段。其中，準(zhǔn)備階段包括試劑的配制和菌株前處理過(guò)程；提取階段包括破壁、純化和收集過(guò)程[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DNA的提取質(zhì)量及其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

菌株DNA的提取質(zhì)量直接關(guān)系到PCR擴(kuò)增的順利進(jìn)行，進(jìn)而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。DNA提取濃度和純度是評(píng)價(jià)其提取質(zhì)量的兩個(gè)重要指標(biāo)[14]。DNA提取濃度低將導(dǎo)致DNA無(wú)法被有效擴(kuò)增，這可能是由于待測(cè)菌株量少、破壁或裂解不充分、沉淀不完全或洗滌時(shí)DNA丟失等造成。DNA提取物不純，表明其中可能含有蛋白、多糖、多酚或金屬離子等雜質(zhì)，將抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。采用堿裂解法對(duì)12株菌株DNA的提取濃度和純度見(jiàn)表1。

表1 采用堿裂解法提取菌株DNA的濃度和純度Table 1 Concentration and purity of strain DNA extracted by an alkaline lysis method

可以看出，所有測(cè)試菌株的DNA提取濃度均處于較高水平（＞40 ng/μL），且其DNA提取純度均較高（純DNA物質(zhì)的A260/A280為1.8～2.0）[15]，這將為后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增提供保障。

采用堿裂解法提取菌株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。可以看出，8株細(xì)菌均在1 500 bp附近出現(xiàn)明顯條帶（圖1A），且4株酵母菌均在500 bp附近出現(xiàn)明顯條帶（圖1B），表明采用堿裂解法提取的細(xì)菌DNA能夠成功擴(kuò)增出16S rDNA，酵母菌DNA能夠擴(kuò)增出26S rDNA，滿足下一步測(cè)序的需要。

圖1 采用堿裂解法提取8株細(xì)菌DNA的PCR產(chǎn)物（A）和4株酵母菌DNA的PCR產(chǎn)物（B）的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis images of 8 strains of bacterial DNA PCR products（A）and 4 strains of yeast DNA PCR products（B）

2.2 菌株核苷酸測(cè)序峰圖分析

對(duì)提取得到的微生物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再分析該擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，進(jìn)而判斷DNA提取方法的優(yōu)劣程度[16-17]。細(xì)菌B116S rDNA和酵母菌F2 26S rDNA的測(cè)序峰圖如圖2所示?？梢钥闯?，細(xì)菌16S rDNA和酵母菌26S rDNA中單向DNA鏈有效序列長(zhǎng)度分別達(dá)到800 bp和500 bp，且測(cè)序信號(hào)清晰，規(guī)律性好，無(wú)雜峰干擾，因此采用堿裂解法提取細(xì)菌和酵母菌的DNA可以滿足菌株鑒定的要求。

圖2 細(xì)菌B1 16S rDNA（A）和酵母菌F2 26S rDNA（B）的核苷酸測(cè)序峰圖Fig.2 Nucleotide sequencing images of the 16S rDNA of strain B1（A）and the 26S rDNA of strain F2（B）

2.3 菌株鑒定結(jié)果分析

基于堿裂解法和試劑盒法對(duì)12株四川泡菜菌株的鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 基于堿裂解法和試劑盒法對(duì)12株四川泡菜菌株的鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of 12 strains obtained from Sichuan pickles by using alkaline lysis method and test kit method

可以看出，8株細(xì)菌和4株酵母菌均被鑒定到種，且同源性達(dá)到99%以上。采用堿裂解法對(duì)12株菌株的鑒定結(jié)果與采用市售試劑盒法的鑒定結(jié)果一致，表明基于堿裂解法提取細(xì)菌和酵母菌DNA的鑒定方法可行，且準(zhǔn)確性高。四川泡菜中分離得到的8株細(xì)菌包括6株乳酸菌和2株腸球菌；4株酵母菌分別為膠紅酵母、常威克漢姆酵母、熱帶假絲酵母和奧默柯達(dá)酵母[18-19]。

2.4 提取菌株DNA的耗時(shí)和成本分析

在測(cè)試成本方面，采用堿裂解法提取菌株DNA的成本僅為50元/100次，遠(yuǎn)低于試劑盒法（>600元/100次），見(jiàn)表3。

表3 采用堿裂解法和試劑盒法提取菌株DNA的成本和耗時(shí)分析Table 3 Cost and time-consuming analyses between alkaline lysis method and test kit method

這主要是由于堿裂解法中使用試劑為價(jià)格低廉的氫氧化鈉和少量的聚醇類(lèi)表面活性劑，而試劑盒法中采用價(jià)格較高的酶制劑[20]。在測(cè)試耗時(shí)方面，采用堿裂解法在準(zhǔn)備階段的耗時(shí)高于試劑盒法，但總耗時(shí)卻較少（50 min），明顯低于試劑盒法總耗時(shí)（125 min）。因此，堿裂解法是一種經(jīng)濟(jì)、快速的提取菌株DNA方法。

3 結(jié)論

基于堿裂解法提取菌株DNA鑒定四川泡菜中8株細(xì)菌分別為植物乳桿菌、乳酸乳球菌、短乳酸菌、假腸膜明串珠菌、檸檬明串珠菌、類(lèi)腸膜魏斯氏菌、鶉雞腸球菌和希氏腸球菌；4株酵母菌為膠紅酵母、常威克漢姆酵母、熱帶假絲酵母和奧默柯達(dá)菌。該方法測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低，適合于發(fā)酵食品中微生物的鑒定。

[1]陳功,夏友書(shū),張其圣,等.從中國(guó)泡菜看四川泡菜及泡菜壇[J].中國(guó)釀造,2010,29(8):5-8

[2]熊濤,關(guān)倩倩,謝明勇.直投式與傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜工藝中病原菌的變化規(guī)律[J].食品科學(xué),2012,33(13):140-143

[3]陳功,余文華,張其圣,等.四川泡菜與乳酸菌的研究[J].中國(guó)釀造,2012,31(9):151-153

[4]CHI Y L,ZHANG Q S,CHEN G,et al.Survival of Escherichia coli O157:H7,nitrite content and sensory acceptance of low-salt Chinese paocai fermented by screened lactic acid bacteria[J].International Journal of Food Science and Technology,2016,51:2178-2184

[5]蔡炯,遲原龍,汪冬冬,等.腐敗四川泡菜菌相構(gòu)成及主要腐敗菌特性分析[J].食品科技,2017,43(1):279-283

[6]VAN BURIL J A,SCHRECKHISE R W,WHITE T C,et al.Comparison of six extraction techniques for isolation of DNA from filamentous fungi[J].Medical Mycology,1998,36:299-303

[7]MELO S C O,PUNGARTNIK C,CASCARDO J C M,et al.Rapid and efficient protocol for DNA extraction and molecular identification of the basidiomycete Crinipellis perniciosa[J].Genetics and Molecular Research,2006,5:851-855

[8]SAMBROOK J,RUSSELL D W.Molecular cloning:a laboratory manual(Third edition)[J].Cold Spring Habor Laboratory,2016,49:895-909

[9]HARUTA S,KONDO M,NAKAMURA K,et al.Microbial community changes during organic solid waste treatment analyzed by double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis and fluorescence in situ hybridization[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2002,60:224-231

[10]TOFALO R,PERPETUINI G,SCHIRONE M,et al.Yeast biota associated to naturally fermented table olives from different Italian cultivars[J].International Journal of Food Microbiology,2013,161:203-208

[11]汪紅,曹瑜,羅時(shí)宇,等.四川泡菜乳酸菌的分離鑒定及其特性研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,45(6):1509-1512

[12]王俊剛,劉成江,郭安民,等.分子生物學(xué)技術(shù)在乳酸菌鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)釀造,2012,31(1):1-4

[13]蔣云露,楊建濤,王猛,等.四川泡菜鹽鹵中微生物總基因組DNA提取方法的比較[J].中國(guó)釀造,2015,34(4):90-92

[14]肖其勝,楊捷琳,丁卓平,等.五種DNA提取方法對(duì)酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比較[J].食品工業(yè)科技,2016,37(3):307-311

[15]徐曉宇,閡航,劉和,等.土壤微生物總DNA提取方法的比較[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2005,13(3):377-381

[16]安云鶴,高麗娟,李俊博,等.PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)細(xì)菌群落多樣性測(cè)序分析的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2016,32(8):1115-1123

[17]董銀萍,崔生輝,李鳳琴,等.乳酸桿菌及嗜熱鏈球菌的種水平鑒定——16SrRNA基因PCR擴(kuò)增及序列分析[J].衛(wèi)生研究,2010,39(4):454-458

[18]曾駿,陳安均,蒲彪,等.傳統(tǒng)四川泡菜中酵母菌的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[J].食品科學(xué),2014,35(7):81-85

[19]劉春燕,戴明福,夏姣,等.傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過(guò)程中酵母菌分離鑒定[J].食品工業(yè)科技,2015,36(5):171-174

[20]李會(huì),任志瑩,王穎,等.不同DNA提取試劑盒提取作物種子基因組DNA效果的比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,52(8):1956-1958