蛋白酶對蟹殼的脫蛋白作用研究

武小芳，張建旭，耿曉杰，王勃穎，郭潤芳，孫紀錄，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代科技學院，河北保定071001）

近年來，隨著螃蟹加工量的增加，蟹殼的產(chǎn)生量也大幅增加，造成了嚴重的環(huán)境污染。蟹殼是甲殼素生產(chǎn)的主要原料之一[1-2]。甲殼素又稱為幾丁質，是第二豐富的自然生物質資源，在食品、醫(yī)藥、化工、紡織、污水處理等領域皆有廣泛應用。蟹殼由甲殼素與蛋白質交織形成的致密基質構成，這些基質通過礦物鹽的沉積加固，這些礦物鹽主要是碳酸鈣。為了獲得甲殼素，必須脫除礦物質和蛋白質[3]。甲殼素的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是在高溫下利用強酸和強堿分別脫礦物質和蛋白質。這種方法會產(chǎn)生廢物處理問題，嚴重污染生態(tài)環(huán)境；同時可能造成甲殼素的部分脫乙?；退?，導致產(chǎn)品的生理特性不一致。隨著對環(huán)境關注度的增加，使用微生物發(fā)酵和蛋白酶處理技術，替代傳統(tǒng)生產(chǎn)甲殼素的方法引起廣泛重視。

微生物發(fā)酵法相對簡單，并且不太昂貴，克服了化學處理的缺點。發(fā)酵上清液中包含了大量的蛋白水解物（氨基酸和多肽），可以將他們收集作為其它微生物的培養(yǎng)基以降低污水處理的成本[4-6]。但是由于其發(fā)酵周期長，微生物培養(yǎng)條件要求嚴格，目前，尚停留在實驗室研究階段，未能大規(guī)模投入生產(chǎn)。利用酶法脫蛋白，反應條件溫和，環(huán)境污染小，操作簡單，對反應儀器設備要求低，水解產(chǎn)物豐富且可回收利用，避免了傳統(tǒng)方法中使用強堿造成的甲殼素質量降低的問題。目前，對甲殼類動物脫蛋白質使用的蛋白酶種類有堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶等。歲姍姍等將胰蛋白酶和木瓜蛋白酶組合對黃粉蟲進行酶解脫蛋白質提取甲殼素，反應溫度對蛋白質的脫除程度影響最大，蛋白質水解液中氨基酸豐富[7]。王紅等利用中性蛋白酶對蝦廢料進行脫蛋白質試驗，處理時間對酶解液的水解度影響效果最明顯[8]。

本研究擬使用蛋白酶對蟹殼脫蛋白質。以蟹殼粉為原料，蛋白質脫除率為主要評價指標，篩選最適蛋白酶種類，然后對蛋白酶添加量、蟹殼粉粒徑、反應溫度、保溫處理時間和pH值進行優(yōu)化，以期研發(fā)一種替代傳統(tǒng)的NaOH堿法脫蛋白的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

AISITE高速萬能粉碎機、WGL-125B鼓風干燥箱：天津市泰勒斯特儀器有限公司；SHA-C恒溫水浴振蕩器：常州國宇儀器制造有限公司；721G可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；3K15低溫冷凍離心機：SIGMA德國公司。

1.2 材料與試劑

堿性蛋白酶（3.57×105U/g）、菠蘿蛋白酶（1.23×105U/g）、木瓜蛋白酶（2.85× 104U/g）、福林（Follin）試劑（分析純）：Biotopped Science公司；三氯乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；四硼酸鈉（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；醋酸（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；檸檬酸（分析純）：天津市鼎盛化工材料廠；鹽酸（分析純）：北京化工廠。

蟹殼：來自河北省黃驊市產(chǎn)梭子蟹。蟹殼粉的制備：將蟹殼水煮1 h，然后清洗，60℃下干燥12 h，將干燥的蟹殼粉碎過篩，過篩目數(shù)分別為40、80、120、160目。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶種類的選擇

將蟹殼粉（120目）按料液比 1∶5（g/mL）加入適宜的緩沖溶液，攪拌均勻。按酶底比7.75 U/mg分別加入堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，混勻。然后，于恒溫水浴搖床中酶解處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘渣至pH值為7左右，將殘渣恒溫干燥至恒重[9]。采用福林酚法測定上清液中蛋白質含量，凱氏定氮法測定殘渣中蛋白質含量，計算雜質脫除率。

1.3.2 蟹殼粉粒徑對脫蛋白質的影響

將目數(shù)為 40、80、120、160目的蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，按酶底比7.75 U/mg添加堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫水浴搖床中保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘渣至pH值為7左右，將殘渣恒溫干燥至恒重。采用福林酚法測定上清液中蛋白質含量，凱氏定氮法測定殘渣中蛋白質含量，計算雜質脫除率。

1.3.3 酶底比對脫蛋白質的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，分別按酶底比為4、8、12U/mg添加堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫水浴搖床中保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘渣至pH值為7左右，將殘渣恒溫干燥至恒重。采用福林酚法測定上清液中蛋白質含量，凱氏定氮法測定殘渣中蛋白質含量，計算雜質脫除率[10]。

1.3.4 溫度對脫礦物質和脫蛋白質的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，按酶底比4 U/mg加入堿性蛋白酶，混勻。然后，分別于 30、40、45、50、60 ℃恒溫水浴搖床中保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘渣至pH值為7左右，將殘渣恒溫干燥至恒重。采用福林酚法測定上清液中蛋白質含量，凱氏定氮法測定殘渣中蛋白質含量，計算雜質脫除率[10]。

1.3.5 保溫處理時間對脫蛋白質的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，按酶底比4 U/mg加入堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫水浴搖床中分別保溫處理至2、4、6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘渣至pH值為7左右，將殘渣恒溫干燥至恒重。采用福林酚法測定上清液中蛋白質含量，凱氏定氮法測定殘渣中蛋白質含量，計算雜質脫除率[10]。

1.3.6 pH值對脫蛋白質的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值分別為9.6、10.0、10.5、11.0的緩沖溶液混合，按酶底比4 U/mg加入堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫循環(huán)水浴中分別保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘渣至pH值為7左右，將殘渣恒溫干燥至恒重。采用福林酚法測定上清液中蛋白質含量，凱氏定氮法測定殘渣中蛋白質含量，計算雜質脫除率。

1.3.7 蛋白質含量的測定

1.3.7.1 固體殘渣中蛋白質含量測定

采用凱氏定氮法[11]。

1.3.7.2 L-酪氨酸標準曲線

參考GB/T 28715-2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定分光光度法》測定[12]。

以酪氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 The standard curve of tyrosine

1.3.7.3 上清液中蛋白質含量測定

用蛋白酶水解蟹殼蛋白質后，通過福林酚顯色測定酶解上清液中蛋白質含量。取1 mL稀釋至一定倍數(shù)的上清液，加入5 mL碳酸鈉溶液和1 mL福林酚試劑，混勻，于40℃恒溫水浴鍋中顯色反應20 min。待顯色完成后，迅速冷卻，測定680 nm波長下吸光值。根據(jù)酪氨酸標準曲線，計算酶解過程中上清液中蛋白質含量[12]。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究利用SPSS 17.0軟件對各單因素試驗數(shù)據(jù)進行分析，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類的選擇

不同種類的蛋白酶對蟹殼粉的脫蛋白質效果見圖2。

由圖2可知，堿性蛋白酶對蟹殼的蛋白質脫除率為71.35%，顯著高于菠蘿蛋白酶處理（58.45%）和木瓜蛋白酶處理（54.40%）（P＜0.05）。經(jīng)堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶對蟹殼脫蛋白質后，上清液中蛋白質含量分別為（5 826.04±239.55）、（4 506.80±190.95）、（2 344.50±531.05）μg/mL，堿性蛋白酶處理后上清液中蛋白質含量也顯著高于其它兩種蛋白酶處理（P＜0.05）。因此，堿性蛋白酶較適宜對蟹殼脫蛋白質。

圖2 不同種類的蛋白酶對蟹殼粉的脫蛋白質效果Fig.2 The efficacy of deproteinization of crab shell powder by different proteases

2.2 蟹殼粉粒徑對脫蛋白質的影響

堿性蛋白酶對不同粒徑的蟹殼粉的脫蛋白質效果見圖3。

圖3 堿性蛋白酶對不同粒徑的蟹殼粉的脫蛋白質效果Fig.3 The efficacy of deproteinization of crab shell powders withdifferent granularity by alkaline protease

由圖3可知，隨著蟹殼粉粒徑的增大，蛋白質脫除率增加，蟹殼粉目數(shù)為160目時蛋白質脫除率為82.25%，顯著高于蟹殼粉目數(shù)為40目（58.59%）、80目（68.38%）和120目（73.23%）（P＜0.05）。蟹殼粉粒徑越大，蛋白酶分子與蟹殼粉的接觸面積增大，因此，能夠促進蛋白酶水解蟹殼中的蛋白質。分別采用目數(shù)為40、80、120、160目的蟹殼粉進行酶解脫蛋白后，上清液中的蛋白質含量分別為（2623.90±93.02）、（3158.40±3.40）、（4 397.47±239.55）、（6 778.42±68.61）μg/mL，上清液中蛋白質含量與蛋白質脫除率變化相符。因此，選擇蟹殼粉目數(shù)為160目較適宜。

2.3 酶底比對脫蛋白質的影響

不同酶底比下蟹殼粉的脫蛋白質效果見圖4。

圖4 不同酶底比下蟹殼粉的脫蛋白質效果Fig.4 The efficacy of deproteinization of crab shell powder under different enzyme/substrate ratio

由圖4可知，隨著蛋白酶添加量的增加，蟹殼粉的蛋白質脫除率先升高后降低，當酶底比達到8 U/mg時，蛋白質脫除率達到最高。但是，經(jīng)單因素方差分析，酶底比為4 U/mg和8 U/mg差異不顯著（P＞0.05）。在酶底比為4、8、12 U/mg時，蟹殼經(jīng)蛋白酶處理后，上清液中蛋白質含量分別為（5 921.57±42.35）、（6 790.57±142.35）、（5 758.01±239.55）μg/mL，變化趨勢與蛋白質脫除率趨勢基本一致。因此，綜合經(jīng)濟成本考慮，選擇酶底比為4 U/mg較適宜。

2.4 溫度對脫蛋白質的影響

不同溫度下蟹殼粉的脫蛋白質效果見圖5。

圖5 不同溫度下蟹殼粉的脫蛋白質效果Fig.5 The efficacy of deproteinization of crab shell powder under different temperatures

由圖5可知，隨著溫度的升高，蟹殼的蛋白質脫除率呈先升高后下降趨勢；當溫度達到45℃時，蛋白質脫除率為80.72%，達到最高，與其他處理差異顯著（P＜0.05）。與之對應，30、40、45、50、60 ℃下酶解處理液的上清液中，蛋白質含量分別為（3 912.97±348.82）、（5 080.02±36.43）、（6 850.57±42.35）、（5 163.41±73.89）、（5 180.02±17.50）μg/mL，變化趨勢與蛋白質脫除率變化一致。因此，選擇45℃為最適溫度。

2.5 保溫處理時間對脫蛋白質的影響

不同保溫處理時間下蟹殼粉的脫蛋白質效果見圖6。

圖6 不同保溫處理時間下蟹殼粉的脫蛋白質效果Fig.6 The efficacy of deproteinization of crab shell powder during different incubation time

由圖6可知，隨著反應時間的延長，蛋白質脫除率逐漸增加，當反應時間超過4 h，蛋白質脫除率基本趨于穩(wěn)定。經(jīng)單因素方差分析，反應4 h與6 h差異也不顯著（P＞0.05）。在反應時間為 2、4、6 h時，上清液中蛋白質含量分別為（3 109.81±45.15）、（5 034.78±31.05）、（5 150.63±93.75）μg/mL，變化趨勢與蛋白質脫除率的變化趨勢基本一致。因此，為了節(jié)約反應時間，綜合蛋白質脫除效果，選擇4 h為最佳保溫處理時間。

2.6 pH值對脫蛋白質的影響

不同pH值下蟹殼粉的脫蛋白質效果見圖7。

圖7 不同pH值下蟹殼粉的脫蛋白質效果Fig.7 The efficacy of deproteinization of crab shell powder under different pH

由圖7可知，pH從9.6到10.0，蛋白質脫除率升高；從10.0到11.0，蛋白質脫除率變化不明顯。經(jīng)單因素方差分析，pH 9.6與其它pH相比，雜質脫除率差異顯著（P＜0.05），在 pH 10.0、10.5和 11.0 下，蛋白質脫除率差異不顯著（P＞0.05）。在 pH 9.6、10.0、10.5 和 11.0下對蟹殼脫蛋白質后，上清液中蛋白質含量分別為（3 842.85±232.55）、（3823.42±358.89）、（3779.68±47.91）、（3 742.85±57.62）μg/mL，上清液中蛋白質含量變化不明顯。因此，綜合比較，pH 10.0到11.0為蛋白酶處理蟹殼脫蛋白質的最適pH范圍。

3 結論

在甲殼素提取過程中，脫蛋白質工序通常采用稀堿法，即利用稀氫氧化鈉溶液在高溫條件下進行。使用強堿易腐蝕設備，且會降低提取的甲殼素的脫乙酰度和分子量，反應結束后脫除的蛋白質無法回收利用，造成化學污染。與之相比，酶促反應條件溫和、無污染、水解產(chǎn)物豐富、對反應設備要求較低、對環(huán)境污染小[13]。

在本研究中，使用蛋白酶對蟹殼脫蛋白質替代傳統(tǒng)方法。結果表明，堿性蛋白酶適宜于蟹殼脫蛋白。其最適脫蛋白質條件為：堿性蛋白酶添加量4 U/mg、蟹殼粉目數(shù)160目、反應溫度45℃、保溫處理時間4 h、pH值10.5，在此條件下，蟹殼粉的蛋白質脫除率為78.54%。本試驗結果為單批次蟹殼粉研究結果，綜合所有批次試驗結果可知，在最優(yōu)試驗條件下，蟹殼粉的蛋白質脫除率約為80%。因此，堿性蛋白酶可以通過酶促反應水解蟹殼中蛋白質，是替代氫氧化鈉脫蛋白質的一種選擇。但是，使用蛋白酶成本較高，將其固定化后利用是較優(yōu)的選擇，這仍需進一步深入研究。

[1]Valdez-Pe?a A U,Espinoza-Perez J D,Sandoval-Fabian G C,et al.Screening of industrial enzymes for deproteinization of shrimp head for chitin recovery[J].Food Science and Biotechnology,2010,19(2):553-557

[2]Abdelrahman R M,Hrdina R,Abdelmohsen A M,et al.Chitin and chitosan from Brazilian Atlantic Coast:Isolation,characterization and antibacterial activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,80:107-120

[3]Sayari N,Sila A,Abdelmalek B E,et al.Chitin and chitosan from the Norway lobster by-products:Antimicrobial and anti-proliferative activities[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,87:163-171

[4]Jo G H,Jung W J,Kuk J H,et al.Screening of protease-producing Serratia marcescens FS-3 and its application to deproteinization of crab shell waste for chitin extraction[J].Carbohydrate Polymers,2008,74(3):504-508

[5]Ghorbel-Bellaaj O,Hmidet N,Jellouli K,et al.Shrimp waste fermentation with Pseudomonas aeruginosa A2:optimization of chitin extraction conditions through Plackett-Burman and response surface methodology approaches[J].International Journal of Biological Macromolecules,2011,48(4):596-602

[6]Giyose N Y,Mazomba N T,Mabinya L V.Evaluation of proteases produced by Erwinia chrysanthemi for the deproteinization of crustacean waste in a chitin production process[J].African Journal of Biotechnology,2010,9(5):702-707

[7]歲姍姍,周祥,周楷.正交試驗法優(yōu)化黃粉蟲甲殼素提取新工藝[J].海南大學學報(自然科學版),2015,32(2):147-151

[8]王紅.南美白對蝦加工廢棄物制備殼聚糖關鍵技術研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2015

[9]Younes I,Ghorbel-Bellaaj O,Nasri R,et al.Chitin and chitosan preparation from shrimp shells using optimized enzymatic deproteinization[J].Process Biochemistry,2012,47(12):2032-2039

[10]Younes I,Hajji S,Rinaudo M,et al.Optimization of proteins and minerals removal from shrimp shells to produce highly acetylated chitin.[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,84:246-253

[11]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5009.5-2010食品安全國家標準食品中蛋白質含量的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[12]全國食品工業(yè)標準化技術委員會工業(yè)發(fā)酵分技術委員會.GB/T 23527-2009,蛋白酶制劑[S].北京:中國標準出版社,2009

[13]Younes I,Hajji S,Frachet V,et al.Chitin extraction from shrimp shell using enzymatic treatment.Antitumor,antioxidant and antimicrobial activities of chitosan[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,69(8):489-498