赤小豆納豆發(fā)酵工藝的研究

付文靜，王家林，張杰

（青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東青島266042）

納豆是一種以黃豆為主要原料，蒸煮后經(jīng)過納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成的古老豆制食品，在日本，食用納豆的歷史已長達兩千多年[1]。納豆中含有豐富的功能物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值，近幾年來成為微生態(tài)食品的研究熱點[2]。納豆中的納豆激酶，具有較強的纖溶活性，可以幫助治療血栓類疾病，降低心腦血管疾病的發(fā)病率，穩(wěn)定血壓，溶解血栓，有望成為新型溶栓制劑[3]，納豆中含有較高含量的維生素K2，可增加骨密度，預防骨質(zhì)疏松，納豆中還含有染料木素和胰蛋白酶抑制劑，能夠抗菌消炎，防毒防癌[4]。赤小豆俗稱紅豆，廣泛種植于我國各地，赤小豆含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物以及VA1、VB1、VB2等功能物質(zhì)，具有清熱解毒、減肥消腫、健脾利濕、消積化瘀等療效，經(jīng)過蒸煮的赤小豆香糯可口，色澤鮮亮，深受人們的喜愛[5]。雖然納豆的營養(yǎng)價值很高，但國人很難接受制作納豆時由于腐敗而產(chǎn)生的氨臭味[6]，導致納豆食品在我國消費群體中尚未普及，很多人對納豆敬而遠之。所以，本試驗在傳統(tǒng)納豆發(fā)酵底物黃豆中添加一定量赤小豆，嘗試改變傳統(tǒng)納豆的風味，以納豆激酶的活性及感官評價為指標進行分析，提高納豆產(chǎn)品的質(zhì)量，改善納豆口味，開發(fā)新產(chǎn)品，促進納豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆、赤小豆：顆粒飽滿，形態(tài)完整，均購自青島市利群超市；納豆芽孢桿菌：青島科技大學生物工程試驗室保藏菌種；纖維蛋白原（分析純）：美國Sigma公司；凝血酶（分析純）：山東日照海峰制藥有限公司；酪蛋白（分析純）：甘南州科瑞乳品開發(fā)有限公司；尿激酶（分析純）：青島邦凱高新技術材料有限公司。

1.2 儀器與設備

離心機（LG10-2.4A）：北京京立離心機有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250）：上海一恒科學儀器有限公司；潔凈工作臺（SW-CJ-1FD）、不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-18SI）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；紫外分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 培養(yǎng)基

酪素培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，酪素5 g，葡萄糖1 g，酵母膏 1 g，K2HPO41 g，KH2PO40.5 g；pH 7.0～7.2，0.1 MPa滅菌30 min。

LB 培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL；pH 7.0～7.2，每試管分裝 2 mL，0.1 MPa滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 5 g，蒸餾水 1 000 mL；pH 7.0～7.2，每個三角瓶分裝200 mL，0.1 MPa滅菌30 min。

1.4 方法

1.4.1 納豆芽孢桿菌的活化及生長曲線的測定

將試驗室保藏菌株在斜面培養(yǎng)基活化24 h，用接種環(huán)小心挑取單菌落，轉(zhuǎn)接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，裝液量為40 mL/250 mL，于37℃、180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)，每隔3小時取種子液，用分光光度計測其OD660數(shù)值，以時間為橫坐標，所測數(shù)值為縱坐標作圖，即為納豆芽孢桿菌生長曲線[7]。

1.4.2 指標評定

1.4.2.1 納豆激酶活性的測定

納豆激酶酶活的具體測定方法是采用了改進的纖維蛋白平板法，尿激酶與納豆激酶具有相似的纖溶活性，當凝血酶與血纖維蛋白原作用后，會產(chǎn)生凝固狀的交聯(lián)血纖維蛋白，此時再加入納豆激酶或尿激酶溶液，納豆激酶或尿激酶就會作用于交聯(lián)血纖維蛋白，使其溶解[8]。

在采用傳統(tǒng)的平板法測酶活時，形成的透明圈往往形狀不均，呈不規(guī)則的圓形，無法直觀的測量透明圈面積，所以，本試驗進行了改進，依照平板法的制作方法[9]，在比色皿內(nèi)，加入一定比例的纖維蛋白原和凝血酶，制成微型纖維平板，然后在每個比色皿內(nèi)加入配置成的不同濃度梯度（125、250、500、1 000、2 000 U）的標準尿激酶。在纖維平板形成反應開始的2 h之間，每隔30分鐘測定一次OD655值；計算出在每個時間內(nèi)的OD655值同初始OD655值的差值ΔOD655。利用最小二乘法算出直線的斜率ΔOD655/h。用計算所得斜率同尿激酶濃度的對數(shù)作圖，便可得到相對應的尿激酶標準曲線。

取不同發(fā)酵條件下的樣品納豆激酶粗酶液10 μL，點樣于比色皿內(nèi)微型纖維平板上，按照相同的方法進行測定其吸光度減少值，參照尿激酶標準曲線，即可比較不同樣品納豆激酶的酶活。

1.4.2.2 感官評定

隨機選取10名青島科技大學海洋科學與生物工程學院志愿者，按照感官評分標準表對赤小豆納豆產(chǎn)品進行打分，分值從0至10分不等。納豆感官評分標準見表1。

表1 納豆感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of natto

1.4.3 工藝流程

按照以下流程對赤小豆納豆進行單因素和正交發(fā)酵試驗。

大豆、赤小豆→精選→清洗→浸泡→蒸煮→接種→發(fā)酵→后熟→成品[10]

1.4.3.1 操作要求

大豆、赤小豆選擇：精選顆粒飽滿、色澤鮮亮的大豆、赤小豆，無沙粒等雜質(zhì)，用清水洗凈；浸泡：過夜浸泡14 h～16 h，水與大豆以質(zhì)量比1∶3的比例進行浸泡；蒸煮：高溫高壓滅菌鍋中于121℃蒸煮30 min，蒸煮豆子至綿軟；接種菌液：以3%的接種量進行接種；待豆子冷卻到50℃左右接種；發(fā)酵：按照試驗設定條件（不同發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、赤小豆與大豆的原料比）進行發(fā)酵；后熟：于4℃左右條件下后熟24 h。

1.4.3.2 單因素試驗

研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、原料比對赤小豆納豆的影響。即保持其中兩個因素不變，改變另一個因素，研究該因素的變化對納豆激酶酶活及感官評價的影響。分別在發(fā)酵溫度為 30、34、38、42、46 ℃；發(fā)酵時間為 10、14、18、22、26 h；赤小豆與黃豆質(zhì)量比為 1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5（共 50 g）的條件下進行試驗，每項因素進行3次平行試驗，取平均值記錄，以納豆激酶產(chǎn)量和感官評價的加權分值為指標進行分析。

綜合分數(shù)=0.5×（納豆激酶酶活/納豆激酶酶活最大值）×10+0.5×（感官評分/感官評分最大值）×10

1.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗設計，以納豆激酶活性和感官評價的加權分值為指標進行工藝的優(yōu)化，以確定最佳發(fā)酵條件。

2 結果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌生長曲線

本試驗所得菌種生長曲線以培養(yǎng)時間（種齡）為橫坐標，以吸光度OD660數(shù)值為縱坐標作圖，可得菌種的生長曲線，納豆芽孢桿菌生長曲線見圖1。

圖1 納豆芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

由圖1可知，納豆芽孢桿菌在3 h～17 h時菌體濃度增長十分緩慢，處于環(huán)境適應期，生長幾乎停滯；17 h～25 h時，在培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)豐富的條件下，菌體大量繁殖，菌體濃度呈指數(shù)上升狀態(tài)；25 h～30 h為生長穩(wěn)定期，菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，菌體開始產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物；30 h后菌體處于衰亡期，此時培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)減少，甚至被消耗殆盡，菌體數(shù)目減少。因此，綜合比較，選用種齡為23 h的芽孢桿菌進行后續(xù)發(fā)酵試驗。

2.2 標準尿激酶曲線

利用紫外分光光度計測定一系列不同濃度標準尿激酶溶液加入微型纖維平板后在655 nm處的吸光度值，以尿激酶酶活對數(shù)為橫坐標，△OD655/h為縱坐標作圖，標準尿激酶曲線見圖2?；貧w方程為y=0.018 33x-0.036 7，R2=0.998 68。

圖2 尿激酶標準曲線Fig.2 Standard curve urokinase activity

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

測定發(fā)酵溫度為 30、34、38、42、46 ℃時赤小豆納豆的感官評分及納豆激酶酶活，計算綜合分數(shù)，發(fā)酵溫度對產(chǎn)品品質(zhì)的影響如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on product quality

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，赤小豆納豆成品的感官評分和納豆激酶活性數(shù)值均為先升高，后降低。當發(fā)酵溫度為38℃時，感官評分和納豆激酶活性都是最高值。納豆芽孢桿菌處于最適溫度時，菌體生長旺盛，其內(nèi)部各種酶代謝活躍，可充分發(fā)揮各自的功用，溫度過高或過低都會影響細菌的代謝與增殖，降低其生理活性，溫度過高也可能引起納豆激酶失活，并且，溫度過高時，納豆色澤暗淡，形態(tài)癟軟，感官評價不佳，因此，確定38℃為赤小豆納豆發(fā)酵的最佳溫度。

2.3.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

測定發(fā)酵時間為 10、14、18、22、26 h 時赤小豆納豆的感官評分及納豆激酶酶活，計算綜合分數(shù)，發(fā)酵時間對產(chǎn)品品質(zhì)的影響如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時間對產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on product quality

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，赤小豆納豆成品的感官評分先升高，后降低，發(fā)酵時間為22 h時產(chǎn)品的感官評價最佳，此時的納豆色澤鮮亮，拉絲細長黏稠，口感潤滑；發(fā)酵時間過短時，無明顯的納豆香氣；發(fā)酵時間過長時，豆類發(fā)酵積累的酸臭和氨味增加，影響感官評價。

而納豆激酶活性隨時間的延長不斷升高。當發(fā)酵時間為10 h～18 h時，酶活急劇升高，當發(fā)酵時間為18 h～26 h時，酶活升高不明顯。因此綜合感官評分和納豆激酶酶活，確定22 h為發(fā)酵時間的最佳值。

2.3.3 原料比對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

測定赤小豆與黃豆質(zhì)量比為1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5∶5時赤小豆納豆的感官評分及納豆激酶酶活，計算綜合分數(shù)，原料比對產(chǎn)品品質(zhì)的影響如圖5所示。

圖5 原料比對產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of feed ratios on product quality

由圖5可知，隨著赤小豆與黃豆的質(zhì)量比的不斷增大，產(chǎn)品感官評分先上升，后下降，在質(zhì)量比為2∶8處出現(xiàn)峰值，此時的赤小豆納豆顏色對比鮮明，秀色可餐。而相比之下，隨著赤小豆與大豆的質(zhì)量比不斷加大，產(chǎn)品的納豆激酶活性呈現(xiàn)下降趨勢，在質(zhì)量比為1∶9處最大，這可能是由于大豆中所含適合納豆菌發(fā)酵的底物營養(yǎng)成分較高。綜合感官評價與納豆激酶活性的最終分數(shù)，選取赤小豆∶黃豆=2∶8，即1∶4為最佳原料比。

2.4 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 赤小豆納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal experimental design and result for fermentation technology optimization of Phaseolus angularis natto

由表2中的數(shù)據(jù)可知，本試驗選取的3個因素對赤小豆納豆的綜合評價影響力大小為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞原料比，通過k值比較可得，最優(yōu)組合為：發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時間22h，赤小豆與納豆原料比2∶8。由于該組合在上述正交試驗的組合中沒有出現(xiàn)，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，與第2、5組試驗相似，因此需要進行追加試驗進行驗證。

在發(fā)酵溫度為38℃，發(fā)酵時間為22 h，赤小豆與納豆原料比為2∶8時進行3次平行試驗發(fā)現(xiàn)，在此條件下進行發(fā)酵所得的赤小豆納豆感官評價較高，色澤、口感均佳，對其進行納豆激酶酶活的測定，酶活達942 U/g，優(yōu)于正交試驗表中的任何一組試驗結果。

3 結論

通過試驗發(fā)現(xiàn)，赤小豆納豆的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時間22 h，赤小豆與黃豆質(zhì)量比為2∶8（即1∶4）。赤小豆納豆與傳統(tǒng)納豆相比，不僅拉絲明顯，保留了納豆細膩潤滑的口感，而且具有赤小豆鮮艷明亮的色澤和香糯可口的品質(zhì)，其外觀顏色飽滿，品嘗起來細膩綿軟，氨味減少，香味增強，輕輕攪動時，黏液多，拉絲程度高，經(jīng)測定，納豆激酶酶活可達942 U/g。

在傳統(tǒng)納豆中添加赤小豆所得的赤小豆納豆，其營養(yǎng)價值與口感均優(yōu)于傳統(tǒng)大豆納豆，口味較符合國人的飲食習慣。赤小豆納豆的研究與開發(fā)，不僅有利于提高赤小豆、大豆的附加值，使資源得到有效地利用，而且有助于人們在享受味蕾的同時改善飲食結構，增強國民體質(zhì)，滿足更多消費者的需求，為納豆產(chǎn)業(yè)在中國的發(fā)展提供了新的思路。

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