靈芝多糖拌種對小麥抗紋枯病的誘導(dǎo)效應(yīng)及生長發(fā)育影響

張中霄 ，王紅艷 ，王開運(yùn)，王東，姜莉莉

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】小麥紋枯病又稱小麥尖眼點(diǎn)?。╯harp eyespot of wheat），是由立枯絲核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染引起的一種世界性的土傳性真菌病害[1-2]，一般使小麥減產(chǎn)10%—20%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn) 50%左右，個(gè)別地塊甚至絕收[3]，已成為中國小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要障礙之一。目前國內(nèi)對該病的防治主要是采用噴灑井岡霉素或者使用三唑類殺菌劑拌種。由于單一或同類殺菌劑的長期頻繁使用，小麥紋枯病菌已對多種殺菌劑產(chǎn)生了敏感性降低的情況，防治效果受到影響[4]。植物免疫誘抗劑能夠激活植物體內(nèi)分子免疫系統(tǒng)，提高植物抗病性[5]，對降低農(nóng)田化學(xué)農(nóng)藥使用量、保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全具有積極作用[6-7]。【前人研究進(jìn)展】研究表明，植株經(jīng)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)后，體內(nèi)產(chǎn)生PR蛋白，其過氧化物酶（POD）、幾丁質(zhì)酶、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均大幅度增加[8]。向妙蓮等[9]研究表明，茉莉酸甲酯能提高水稻葉片中 POD、過氧化氫酶

究物的生產(chǎn)導(dǎo)表相除等系長多的導(dǎo)苗紋（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、PPO和 PAL活性，誘導(dǎo)水稻幼苗對白葉枯病的抗性。張文清等研

表明，殼寡糖、香菇多糖等多種功能糖能夠調(diào)節(jié)作生長，誘導(dǎo)激活植株的防御反應(yīng)，增強(qiáng)植物對病害抵抗能力，從而誘導(dǎo)植株對植物病毒和真菌病害產(chǎn)抗性[10-11]。海帶多糖可刺激葡萄、水稻和煙草細(xì)胞生防御反應(yīng)，將其施用于葡萄和煙草植株上可誘植株體內(nèi)植保素的累積和一系列病程相關(guān)蛋白的達(dá)[12-14]。靈芝多糖與許多已經(jīng)報(bào)道的真菌多糖結(jié)構(gòu)一致，同屬于β-(1→3)-葡聚糖類[15-17]，能夠有效消生物體內(nèi)的各種自由基，延緩植株衰老[18]。寧玉波[19]報(bào)道靈芝多糖能夠誘導(dǎo)番茄植株對灰霉病產(chǎn)生統(tǒng)抗病性，同時(shí)對番茄種子發(fā)芽和番茄植株幼苗生具有一定的促進(jìn)作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于靈芝糖拌種防治小麥紋枯病目前尚未見報(bào)道?！緮M解決關(guān)鍵問題】以小麥為研究對象，以靈芝多糖作為誘子，通過拌種的方式研究靈芝多糖對小麥發(fā)芽、幼生長和根系活力的影響。觀察靈芝多糖誘導(dǎo)小麥抗枯病的效果，并通過測量小麥體內(nèi)保護(hù)酶的活性、丙二醛（MDA）以及葉綠素a、葉綠素b的含量來探究其誘抗機(jī)制，為靈芝多糖拌種在小麥病害防治上的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2015—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 供試材料

小麥品種：選用對小麥紋枯病的高感品種濟(jì)麥22、中感品種山農(nóng)23、中抗品種魯原502，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；供試藥劑：25%靈芝多糖原粉由濟(jì)寧圣鵬化工有限公司提供；供試菌株：小麥紋枯病菌由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌種，經(jīng)活化、純化后供試。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥發(fā)芽和出苗試驗(yàn) 將靈芝多糖按照4、8 g a.i./100 kg小麥種子的劑量進(jìn)行拌種處理。發(fā)芽試驗(yàn)：參照李山東等[20]方法略有改動(dòng)，記錄并計(jì)算各處理的發(fā)芽勢和發(fā)芽率。計(jì)算公式：發(fā)芽勢（%）=（第3天各處理發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)）×100；發(fā)育率（%）=（第6天各處理發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)）×100。出苗試驗(yàn)：參照黨志紅等[21]方法略有改動(dòng)，小麥拌種后置于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中培養(yǎng)，于出苗后7、14、21 d記錄作物的生長狀況，統(tǒng)計(jì)各處理間的株高。

1.2.2 靈芝多糖拌種對小麥根系活力影響的測定

根系活力的測定采用TTC法[22]。

1.2.3 靈芝多糖拌種對小麥葉綠素含量影響的測定 參考彭運(yùn)生等[23]的方法，測定不同濃度的靈芝多糖處理21 d后對小麥葉綠素a和葉綠素b含量的影響。

1.2.4 靈芝多糖盆栽防效 將靈芝多糖按照 4、8 g a.i./100 kg小麥種子的劑量拌種，以清水處理為對照（CK）。將營養(yǎng)一致、顆粒均勻、含水量約60%的土壤裝于塑料花盆中。每盆混入20 mL相同濃度的紋枯病菌培養(yǎng)液后，播種10粒處理過的種子為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于溫室中培養(yǎng)，于出苗后7、14、21 d記錄發(fā)病率和病情指數(shù)。按照公式（1）和（2）分別計(jì)算。

1.2.5 抗病相關(guān)酶的活性測定 粗酶液的制備參照劉太國等[24]方法略有改動(dòng)。于靈芝多糖處理小麥種子出苗21 d后，取小麥最上端的葉片用于測定過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性。POD活性的測定參考愈創(chuàng)木酚法[25]；SOD活性測定采用NBT光化還原法[26]：PAL活性測定采用李合生[27]的方法。

1.2.6 靈芝多糖拌種對小麥 MDA含量影響的測定參照李合生[27]的方法，采用硫代巴比妥酸法測定MDA 的含量（μmol·g-1）。

2 結(jié)果

2.1 靈芝多糖拌種對小麥生長發(fā)育的影響

2.1.1 對小麥種子發(fā)芽的影響 靈芝多糖拌種后小麥發(fā)芽勢均高于對照，其中高感品種濟(jì)麥22和中感品種山農(nóng)23與對照組差異顯著。劑量為4 g a.i./100 kg小麥種子的靈芝多糖拌種后濟(jì)麥22、山農(nóng)23和魯原502的發(fā)芽勢為53.50%、52.75%、51.50%，高于對照的50.25%、50.50%、50.50%。對照完全發(fā)芽后，靈芝多糖拌種處理組與對照組的發(fā)芽率均接近 100%，無顯著性差異（表1）。

表1 靈芝多糖拌種對小麥種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of G. lucidum polysaccharides (GLP) seed dressing on germination of wheat

2.1.2 對小麥幼苗生長的影響 靈芝多糖種子處理對小麥生長具有促進(jìn)作用，靈芝多糖處理3個(gè)品種小麥種子完全出苗后7、14 和21 d的株高均顯著高于對照。在小麥完全出苗7 d，靈芝多糖8 g a.i./100 kg種子處理組的濟(jì)麥22、山農(nóng)23和魯原502株高分別為8.81、8.75和11.96 cm，顯著高于靈芝多糖4 g a.i./100 kg種子處理組的 8.03、7.50和 9.84 cm和對照組的7.35、6.28和7.01 cm，可見隨著靈芝多糖濃度的升高對小麥初期發(fā)育的促進(jìn)作用更加明顯。在小麥完全出苗21 d后靈芝多糖兩個(gè)處理組的株高沒有顯著差異，但都顯著高于空白對照組（表2）。

表2 靈芝多糖拌種對小麥幼苗生長的影響Table 2 Effect of GLP seed dressing on the growth of wheat seedlings

2.1.3 對小麥根系活力的影響 靈芝多糖拌種能顯著提高小麥根系的活力。靈芝多糖8 g a.i./100 kg種子處理后21 d濟(jì)麥22、魯原502和山農(nóng)23的根系活力分別為 0.26、0.33 和 0.26 mg·g-1·h-1，顯著高于4 g a.i./100 kg種子處理的根系活力（0.19、0.28、0.20 mg·g-1·h-1）以及空白對照的根系活力（0.10、0.21 和0.11 mg·g-1·h-1）（圖 1）。

2.1.4 對小麥葉片葉綠素 a和葉綠素 b含量的影響靈芝多糖拌種后小麥葉片葉綠素a和葉綠素b的含量均有所上升。靈芝多糖4 g a.i./100 kg種子處理后，濟(jì)麥22、魯原502和山農(nóng)23葉綠素a的含量為1.54、1.53、1.86 mg·g-1，顯著高于空白對照 1.29、1.33和1.51 mg·g-1；葉綠素 b的含量為 0.80、0.79和 0.90 mg·g-1，顯著高于空白對照 0.67、0.67 和 0.76 mg·g-1。并且隨著靈芝多糖使用量的提高，葉綠素a和葉綠素b的含量也是有明顯上升（圖2）。

圖1 靈芝多糖拌種對小麥根系活力的影響Fig. 1 Effect of GLP on root activity of wheat

圖2 靈芝多糖拌種對小麥葉片葉綠素含量的影響Fig. 2 Effect of GLP seed dressing on the chlorophyll content of wheat leaves

2.2 靈芝多糖拌種對小麥紋枯病的誘導(dǎo)作用

劑量為4和8 g a.i./100 kg種子的靈芝多糖拌種處理后，對小麥紋枯病均具有一定的防治效果。其中，8 g a.i./100 kg種子劑量的靈芝多糖拌種處理，在小麥出苗 7 d后對小麥紋枯病的防治效果均在30%以上，并且持效期較長，對濟(jì)麥 22、山農(nóng) 23和魯原502的21 d的防治效果分別為30.4%、26.6%和29.4%（表3）。

2.3 靈芝多糖拌種對小麥防御酶活性和 MDA含量的影響

靈芝多糖拌種后小麥葉片防御酶的活性顯著上升。4 g a.i./100 kg種子處理21 d后，濟(jì)麥22、魯原502和山農(nóng)23 PAL活性分別為60.32、57.52和53.12 U·min-1·g-1FW，顯著高于空白對照的55.06、53.60和50.53 U·min-1·g-1FW。而 8 g a.i./100 kg 種子劑量靈芝多糖處理與4 g a.i./100 kg處理組并沒有顯著差異（圖3-A）。SOD、POD活性顯著上升，并且隨靈芝多糖處理濃度的升高而升高，當(dāng)處理濃度為8 g a.i./100 kg時(shí)防御酶活性達(dá)到頂峰。8 g a.i./100 kg種子劑量靈芝多糖拌種后濟(jì)麥22、魯原502和山農(nóng)23的POD活性分別為 135.67、137.53 和 129.73 U·min-1·g-1FW，是空白對照的1.13、1.18和1.17倍（圖3-B）；SOD活性分別為2.45、2.34和2.55 U·g-1FW，是空白對照的1.32、1.26和1.21倍（圖3-C）。

靈芝多糖拌種后，3個(gè)小麥品種葉片 MDA的含量均顯著降低。8 g a.i/100 kg靈芝多糖處理濟(jì)麥22、魯原502和山農(nóng)23種子21 d后，MDA的含量為分別1.48、1.38 和 1.58 μmol·g-1，比空白對照降低 26.1%、27.1%和19.7%（圖3-D）。

圖3 靈芝多糖拌種對小麥葉片保護(hù)酶活性及丙二醛含量的影響Fig. 3 Dynamic curve of protective enzyme activities and content of MDA after GLP seed dressing in wheat

3 討論

植物免疫誘抗劑能夠提高農(nóng)作物抗性和有效防控農(nóng)作物病害。2002 年，ASAI等[28]報(bào)道植物本身存在有效的保護(hù)機(jī)制，可幫助植物抵抗霉菌和細(xì)菌的侵染。真菌多糖具有促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長的作用，單宏英等[29]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖可以促進(jìn)煙草種子的萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖拌種后可增強(qiáng)小麥發(fā)芽勢和幼苗生長。植株葉綠素含量的高低直接反映光合作用的強(qiáng)弱，葉綠素含量越高葉片光合作用越強(qiáng)，產(chǎn)生的能量和積累的有機(jī)物質(zhì)也就越多，抗性也隨之增強(qiáng)。顏惠霞等[30]研究表明，南瓜葉片中葉綠素含量與南瓜品種對白粉病的抗性呈正相關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靈芝多糖拌種后小麥葉片的葉綠素a和葉綠素b均顯著提高，表明靈芝多糖拌種可以在一定程度上提高小麥的光合作用，增強(qiáng)植物的抗病性。

表3 靈芝多糖拌種對小麥紋枯病的誘導(dǎo)作用Table 3 Induction effect of GLP seed dressing against sharp eyespot of wheat

國內(nèi)外已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了真菌多糖能調(diào)節(jié)作物生長、激活植物機(jī)體免疫、誘導(dǎo)植株自身產(chǎn)生抗病性，使植株獲得系統(tǒng)抗病性（systemic acquired resistance，SAR）[31-35]。本研究結(jié)果證明，用不同濃度的靈芝多糖對3個(gè)小麥品種拌種處理，均可誘導(dǎo)小麥對紋枯病產(chǎn)生抗性。靈芝多糖8 g a.i./100 kg拌種后對小麥紋枯病的防治效果在30%以上，并且持效期可達(dá)到21 d。小麥不同品種對小麥紋枯病的抗性存在差異，為降低試驗(yàn)的偶然性，筆者選用對小麥紋枯病高感品種濟(jì)麥22、中感品種山農(nóng)23、中抗品種魯原502進(jìn)行靈芝多糖的誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)，然而3個(gè)不同品種經(jīng)靈芝多糖拌種后對小麥紋枯病的防治效果上并沒有顯著差異，這可能是因?yàn)闇厥遗柙栽囼?yàn)人為促使小麥發(fā)生紋枯病害，導(dǎo)致不同品種之間的差異性并不顯著。

王關(guān)林等[36]研究表明，植物抗逆境的能力與保護(hù)酶活性有著十分密切的關(guān)系。PAL是植物苯丙烷類代謝途徑的限速酶和關(guān)鍵酶，參與植物類黃酮、木質(zhì)素和香豆酸酯類等次生代謝的形成，對植物的抗蟲、抗病、抗逆及生長發(fā)育具有重要作用[37-41]。POD活性與植物的抗病性具有正相關(guān)性，能夠延緩植物衰老[42-43]，并且SOD和POD可以協(xié)同作用清除活性氧自由基，以減輕活性氧自由基對植株的危害。本試驗(yàn)表明，靈芝多糖拌種后的小麥植株體內(nèi)PAL、POD和SOD活性均較對照組有所提高，這可能是在一定程度上提高小麥對紋枯病菌侵染能力的防御機(jī)制之一。MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量可反映植物對逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱和細(xì)胞膜損傷程度[44]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)靈芝多糖拌種后小麥植株MDA含量明顯低于空白對照處理組的含量，表明經(jīng)靈芝多糖拌種后對 MDA含量有一定的抑制作用，從而可減少膜質(zhì)過氧化作用對細(xì)胞的傷害，提高植株對病害的抗逆能力。由于小麥紋枯病為土傳病害并且病菌致病力強(qiáng)，誘導(dǎo)劑的效果不易發(fā)揮，靈芝多糖作為抗病誘導(dǎo)劑單獨(dú)使用防治小麥紋枯病效果不十分顯著。在使用化學(xué)殺菌劑防治植物病害的同時(shí)，通過配施生物誘抗劑提高植物抗病性、促進(jìn)作物生長，是降低化學(xué)藥劑使用量并保證作物產(chǎn)量的有效途徑。李鵬鵬[45]報(bào)道，香菇多糖和新型殺菌劑氟嘧菌酰胺和適量混用，或兩者交替使用，能夠分別減少氟嘧菌酰胺用量的25%和50%，并且明顯提高對黃瓜霜霉病的防治效果；WILINGHAM 等[46]報(bào)道，嘧菌酯與氟唑活化酯（BTH）聯(lián)合施用對百香果瘡痂病的防治持效期可達(dá)25 d以上。近年來，如何減少農(nóng)藥使用量降低農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留成為普遍關(guān)注的問題，生物誘抗劑與化學(xué)藥劑聯(lián)合使用不僅能夠增強(qiáng)對植物病害的防治效果，還能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量并延長藥劑的持效時(shí)間，將成為未來防治植物病害的研究熱點(diǎn)。

4 結(jié)論

靈芝多糖拌種能夠誘導(dǎo)小麥植株抗紋枯病，小麥經(jīng)8 g a.i./100 kg種子劑量的靈芝多糖拌種后對小麥紋枯病的防治效果在30%左右。經(jīng)靈芝多糖拌種后小麥葉片防御酶的活性提高，葉綠素的含量增加，丙二醛的含量降低。同時(shí)靈芝多糖拌種對小麥種子發(fā)芽和幼苗生長具有一定的促進(jìn)作用。

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