微生態(tài)制劑活菌數(shù)方法研究進(jìn)展

王畢英，王洪麗，劉彥民

（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

微生態(tài)制劑源自于微生態(tài)學(xué)原理學(xué)，其具有保護(hù)或調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡的功能，通過(guò)對(duì)宿主產(chǎn)生益生菌或者通過(guò)促進(jìn)有益物質(zhì)生成而制備成的制劑，主要起到預(yù)防、調(diào)節(jié)和治療疾病的作用。平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋，將稀釋后的樣品在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后得到的樣品中所含菌落的數(shù)量，在一般情況下認(rèn)為將一個(gè)肉眼直觀可以看見(jiàn)的菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。選擇一個(gè)合適的稀釋度并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就可以比較準(zhǔn)確地獲得樣品中微生物的具體數(shù)量。平板菌落計(jì)數(shù)法以其具有良好的重復(fù)性，并可以相對(duì)準(zhǔn)確地體現(xiàn)樣品中活菌數(shù)量的優(yōu)點(diǎn)，成為了如今我國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定所認(rèn)定可行的方法，并且在食品藥品研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

1 微生物活菌計(jì)數(shù)方法分析

1.1比濁法

在進(jìn)行微生物液體培養(yǎng)時(shí)，活菌的增加導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁度的增加，該方法能夠簡(jiǎn)單、快速、直觀地觀察活菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)并且可以運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)定其含量，但在測(cè)定時(shí)未能判斷微生物的死活，所以該測(cè)定方法不太準(zhǔn)確。

1.2 含氮量測(cè)定法

大多數(shù)微生物的含氮量比例較一致，根據(jù)含氮量再乘以一定的數(shù)值即可測(cè)得其粗蛋白的含量，從而大致可以得到活菌的生長(zhǎng)情況，傳統(tǒng)方法常用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，該方法具有廣泛的適應(yīng)性、操作簡(jiǎn)單易行、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，但是其只能測(cè)得有機(jī)氮的含量，所以其測(cè)定結(jié)果不太準(zhǔn)確。

1.3 血球計(jì)數(shù)板法

此法是在顯微鏡下直接進(jìn)行測(cè)定，方便快捷并且儀器損耗較小，但在一定的容積中微生物的個(gè)體數(shù)目包括死活細(xì)胞均被計(jì)算在內(nèi)，還有微小雜物也被計(jì)算在內(nèi)，這樣得出結(jié)果往往偏高，因此適用于對(duì)形態(tài)個(gè)體較大的菌體計(jì)數(shù)。

1.4 液體稀釋法

對(duì)活菌進(jìn)行連續(xù)的10倍系列稀釋，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查MPN表（最大可能數(shù)表），再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)就可計(jì)算其中的活菌含量，該方法可較準(zhǔn)確計(jì)算活菌數(shù)，但操作過(guò)程比較繁瑣。

1.5 平板菌落計(jì)數(shù)法

取一定體積的稀釋菌液涂布在合適的固體培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞；統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)，但其操作繁瑣，需要培養(yǎng)一定時(shí)間才能獲得，而且測(cè)定結(jié)果受多種試驗(yàn)因素（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基等）的影響，但是該方法能夠相對(duì)準(zhǔn)確地獲得活菌數(shù)量的信息，所以被廣泛應(yīng)用。

2 影響微生物活菌數(shù)的因素

2.1 培養(yǎng)基對(duì)活菌的影響

不同培養(yǎng)基中所含的成分與含量都不盡相同，例如最簡(jiǎn)單的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其主要成分就是牛肉浸液和蛋白胨，其主要功能是用于細(xì)菌的增菌、檢驗(yàn)；再在此基礎(chǔ)上會(huì)有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，可加入葡萄糖、血液、生長(zhǎng)因子等特殊成分，供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和需要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)，所添加的成分不同，對(duì)活菌的影響就會(huì)不同；除此之外，鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入抑制劑，去抑制標(biāo)本中的雜菌生長(zhǎng)，有助于對(duì)所選擇的細(xì)菌種類的生長(zhǎng)，主要用于區(qū)分目標(biāo)菌，不同培養(yǎng)基的用途不同，其中不論是碳源或是氮源的含量均會(huì)對(duì)活菌數(shù)形成產(chǎn)生影響。

嚴(yán)佩峰等人[1]研究脫脂乳、脫脂乳酶解液和MRS 3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到脫脂乳酶解液是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種較好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，保加利亞乳桿菌在該培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)活菌數(shù)最高。張紅艷等人[2]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)碳源和氮源是影響地衣芽孢桿菌活菌數(shù)的主要因素，其中玉米粉對(duì)地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)影響最大。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)活菌的影響

根據(jù)活菌生長(zhǎng)繁殖速率的不同，可將生長(zhǎng)曲線大致分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，所以活菌在不同時(shí)間之下進(jìn)行培養(yǎng)都會(huì)對(duì)活菌的數(shù)量造成影響，其中，細(xì)菌在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)迅速，活菌數(shù)以恒定的幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線圖上細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)呈直線上升，達(dá)到頂峰狀態(tài)，期間細(xì)菌的形態(tài)、染色性、生物活性等都較典型，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，所以常會(huì)選取對(duì)數(shù)期的活菌作為研究對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)。

高業(yè)成[3]將嗜酸乳桿菌采用傾注的接種方式于36℃分別在24，48，72 h進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果得到嗜酸乳桿菌在培養(yǎng)到72 h時(shí)，可以更加容易觀察菌斑，所以嗜酸乳桿菌的最佳觀測(cè)期為72 h。閆亞梅[4]研究發(fā)現(xiàn)在選用保加利亞乳桿菌進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，當(dāng)將其培養(yǎng)至48 h時(shí)，活菌數(shù)最高且容易觀察。

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)活菌的影響

溫度是通過(guò)影響微生物膜的液晶結(jié)構(gòu)、酶和蛋白質(zhì)的合成與活性，以及RNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄等影響微生物的生命活動(dòng)，具體表現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面，隨著微生物所處環(huán)境溫度升高，微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和酶活性增強(qiáng)，生物化學(xué)反應(yīng)加快，生長(zhǎng)速率提高；另一方面，隨溫度上升，微生物細(xì)胞中對(duì)溫度較敏感的組成成分（如蛋白質(zhì)、核酸等）會(huì)受到不可逆的破壞。超過(guò)最適溫度以后，生長(zhǎng)速率隨溫度升高而迅速下降。

易文芝[5]對(duì)益生菌發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)菌株在37℃進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以得到較高活菌數(shù)。張巖等人[6]研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳桿菌在4℃的條件下進(jìn)行保存可以得到最佳活菌數(shù)，對(duì)延長(zhǎng)乳酸乳桿菌活力提供了有力的支持。李志成等人[7]研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵溫度下所制得的凍干發(fā)酵劑活菌數(shù)均有很大不同，其中于30℃條件下進(jìn)行發(fā)酵所制得的凍干發(fā)酵劑的活菌數(shù)最高。

2.4 接種方式對(duì)活菌的影響

常見(jiàn)的微生物接種方法有平板涂布法與液體傾倒法，平板涂布法不僅可以用于計(jì)算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長(zhǎng)形成菌苔的特點(diǎn)用于檢測(cè)化學(xué)因素對(duì)微生物的抑殺效應(yīng)，其可以計(jì)數(shù)，可以觀察菌落特征，還可以進(jìn)行菌種的分離，但接種前需梯度稀釋，吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延；液體傾倒法相較平板涂布法簡(jiǎn)單，將液體迅速直接傾注于平皿，防止污染即可。

曾理等人[8]研究發(fā)現(xiàn)在采用平板涂布法測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)時(shí)，該法操作較為簡(jiǎn)便，且經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)乳酸菌的生長(zhǎng)狀況良好，同時(shí)能夠更加容易觀察到乳酸菌的菌斑狀態(tài)，對(duì)乳酸菌的活菌計(jì)數(shù)非常適合。高業(yè)成[3]通過(guò)對(duì)嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別進(jìn)行平板涂布法和液體傾倒法進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示以上2種方法對(duì)活菌數(shù)的影響并沒(méi)有顯著差異。

2.5 微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化對(duì)活菌的影響

不同發(fā)酵工藝會(huì)對(duì)活菌的活力產(chǎn)生影響，在不同發(fā)酵條件下所得到的活菌存活率均有所不同，如果想要得到最高活菌數(shù)，必須控制其發(fā)酵條件，其中對(duì)發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的控制尤為重要。

陳慶彩等人[9]研究發(fā)現(xiàn)以鼠李糖乳桿菌和瑞士乳桿菌二者進(jìn)行共培養(yǎng)和發(fā)酵，在初始酸堿度值6.8，接種量6%，發(fā)酵溫度37℃，鼠李糖乳桿菌與瑞士乳桿菌的接種比例2∶1，除此之外，瑞士乳桿菌提前接種3 h，在這個(gè)條件下，得到乳酸菌的活菌數(shù)最高。吳楠等人[10]研究發(fā)現(xiàn)影響德氏乳桿菌活菌數(shù)的主要因素是發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與接種量，其中發(fā)酵時(shí)間為最重要的影響因素。

2.6 其他因素對(duì)活菌的影響

除了以上所論述的一些常規(guī)影響條件外，還有其他因素，如水分含量、其他添加物質(zhì)等會(huì)對(duì)活菌數(shù)產(chǎn)生影響。

劉秀清等人[11]研究發(fā)現(xiàn)不同益生元對(duì)鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)發(fā)酵產(chǎn)生影響，其中低聚異麥芽糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)促進(jìn)作用效果最佳。郭羽等人[12]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)的作用，除此之外，還可以改善鼠李糖乳桿菌的穩(wěn)定性。鮑志寧等人[13]研究水分對(duì)干酪乳桿菌的影響，發(fā)現(xiàn)在添加了保護(hù)劑聚葡萄糖的時(shí)候會(huì)使活菌變得更加穩(wěn)定，對(duì)活菌數(shù)的影響不大。楊郁等人[14]研究發(fā)現(xiàn)，低聚糖對(duì)植物乳桿菌的影響較大，相較葡萄糖而言，可以運(yùn)用低聚糖對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵。

3 結(jié)語(yǔ)

活菌數(shù)作為一種能夠考查微生態(tài)制劑安全性的質(zhì)量控制指標(biāo)，提高微生態(tài)制劑的活菌數(shù)能夠極大地保持制劑的穩(wěn)定性，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間作為影響活菌數(shù)的重要因素，通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化得到其最適發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間，對(duì)活菌數(shù)的提高有益處。另一方面，平板活菌計(jì)數(shù)法也可應(yīng)用于檢測(cè)微生態(tài)制劑類的活菌數(shù)量，活菌數(shù)作為能夠指示微生態(tài)制劑品質(zhì)好壞與保存時(shí)間長(zhǎng)短的最直觀指標(biāo)，一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)。