血瘀證動(dòng)物模型制備與思考

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中醫(yī)證候模型是1960年的鄺安堃等在試驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)大劑量皮質(zhì)激素能誘發(fā)小鼠出現(xiàn)相似于人體陽(yáng)虛證的征象。直至20世紀(jì)90年代，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展及現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，血瘀證動(dòng)物模型的研究出現(xiàn)井噴式發(fā)展，但彼時(shí)的動(dòng)物模型只是單一因素造模，且缺乏診斷標(biāo)準(zhǔn)。2006年田金洲等提出了從“因”“脈”“證”“治”4個(gè)思路作為建立血瘀證動(dòng)物模型的依據(jù)，為模型研究提供了新的思路與方法[1]。近年來(lái)隨著病證結(jié)合研究的深入，相繼涌現(xiàn)出一批血瘀病證結(jié)合模型，為中藥藥理研究和血瘀證機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?，F(xiàn)對(duì)近10年關(guān)于血瘀證動(dòng)物模型的研究概況綜述如下。

1 血瘀證模型制備方法

1.1 依據(jù)病因制備動(dòng)物模型

1.1.1 氣虛血瘀 《讀醫(yī)隨筆》曰：“氣虛不足以推動(dòng)，則血必有瘀。”氣帥血行，血瘀多由氣虛日久而至。多數(shù)學(xué)者根據(jù)中醫(yī)“久行耗氣、勞則耗氣”的原理造成氣虛。如黃爍等[2]提出大鼠疲勞跑步運(yùn)動(dòng)結(jié)合左冠狀動(dòng)脈前降支高位結(jié)扎，結(jié)果主癥、兼癥、舌象、脈象、血液流變學(xué)、凝血功能等均符合氣虛血瘀證候表現(xiàn)，成功建立大鼠氣虛血瘀證模型。蔡光先等[3]采取力竭游泳加皮下注射腎上腺素復(fù)制氣虛血瘀模型，該類(lèi)模型動(dòng)物表征符合氣虛血瘀證的表現(xiàn)，可見(jiàn)到血液流變學(xué)紊亂、凝血指標(biāo)異常。也有學(xué)者采用睡眠剝奪、飲食攝入不足造成氣虛。苗蘭等[4]采用不可預(yù)知的慢性睡眠剝奪復(fù)合半高脂高糖飲食成功建立了氣虛血瘀中醫(yī)證候動(dòng)物模型，模型的血脂代謝紊亂、血液流變學(xué)、血管活性分子、心功能等指標(biāo)符合氣虛血瘀證的病機(jī)特點(diǎn)。廖慧玲等[5]采取饑餓、高脂飲食、寒濕或驚恐也建立了氣虛血瘀證模型，并發(fā)現(xiàn)該模型動(dòng)物血液黏度異常增高，符合血瘀證的病理生理學(xué)表現(xiàn)。

1.1.2 寒凝血瘀 《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》曰：“血?dú)庹撸矞囟鴲汉?，寒則泣不能流”。寒性凝滯，血行不暢而至血瘀。謝波等[6]將大鼠浸泡于冰水環(huán)境中，冰水持續(xù)刺激15 min～20 min，直至大鼠出現(xiàn)呼吸微弱、腿部僵直、反應(yīng)遲鈍欲沉?xí)r取出，每日1次，連續(xù)刺激15 d，最后觀察血常規(guī)、血液流變學(xué)、卵巢和子宮指數(shù)等指標(biāo)的變化，建立了寒凝血瘀證動(dòng)物模型。趙珊珊等[7]采用全身冷凍法造模，將各大鼠獨(dú)自放置于鐵網(wǎng)罩的瓷盤(pán)上，置于-20 ℃的低溫冰柜中持續(xù)受凍1 h，待大鼠出現(xiàn)喜扎堆、反應(yīng)遲鈍、呼吸弱、爪尾部紫暗、唇周發(fā)黑等癥狀時(shí)取出，每日1次，最后通過(guò)血液流變學(xué)、血漿內(nèi)皮素、一氧化氮、血清促甲狀腺素、腎上腺素等指標(biāo)的變化，證明14 d為寒凝血瘀證大鼠模型最佳冷凍時(shí)間。周華妙等[8]采取冰浴法加腎上腺素皮下注射造模。該類(lèi)動(dòng)物模型可出現(xiàn)活動(dòng)減少、進(jìn)食下降、毛發(fā)變黃無(wú)光澤、大便溏稀或干結(jié)臭穢、體質(zhì)量增加緩慢、舌質(zhì)紫暗或有瘀斑等寒凝血瘀表征，也伴有血液流變學(xué)、耳溫、形態(tài)學(xué)、凝血系統(tǒng)等指標(biāo)變化。

1.1.3 氣滯血瘀 《血證論·吐血》曰：“氣結(jié)則血凝”。情志不舒，所欲不遂至肝氣郁結(jié)，氣為血之帥，氣滯則血停。梁耀月等[9]采用慢性不可預(yù)知性刺激如夾尾、噪聲、電刺激、禁食水、晝夜顛倒等建立氣滯血瘀模型，大鼠出現(xiàn)血脂水平下降，情志異常，紅細(xì)胞變形性、心功能均發(fā)生異常。任建勛等[10]采用模擬飲食失調(diào)結(jié)合電刺激、噪聲、光建立模型，通過(guò)對(duì)病因病機(jī)的變化以及血管活性分子、血脂、血液流變學(xué)等指標(biāo)的分析，成功復(fù)制了氣滯血瘀中醫(yī)證候模型。和嵐等[11]注射腎上腺素模擬氣滯血瘀大鼠模型，并應(yīng)用川芎、丹參等藥物治療干預(yù)，其結(jié)果成功反證建立氣滯血瘀證動(dòng)物模型。

1.1.4 陽(yáng)虛血瘀 《讀醫(yī)隨筆》曰：“陽(yáng)虛必血凝”。陽(yáng)氣溫通血脈，陽(yáng)氣虛則生內(nèi)寒，內(nèi)寒則使血液凝滯而血瘀。鄭小偉等[12]將大鼠置于瓷盤(pán)上，放于-15 ℃的低溫冷柜中，持續(xù)受凍4 h，至大鼠出現(xiàn)畏寒喜暖、寒戰(zhàn)停止、少動(dòng)、昏昏欲睡、無(wú)神、反應(yīng)遲緩、呼吸微弱、皮毛無(wú)光澤、唇黑舌暗、心率減慢時(shí)立即脫離冷環(huán)境，并通過(guò)病理形態(tài)學(xué)檢查成功建立了陽(yáng)虛血瘀大鼠模型。

1.1.5 痰濁血瘀 若過(guò)食肥膩，或情志不暢，致脾失健運(yùn)而痰濁內(nèi)生，痰阻血瘀，痰瘀互結(jié)。趙玲等[13]給大鼠喂養(yǎng)高脂飲食，采用終點(diǎn)取齊法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飼養(yǎng)第8周開(kāi)始，三酰甘油和總膽固醇均升高，紅細(xì)胞變形系數(shù)顯著下降，血液呈“黏”“濃”“凝”“聚”狀態(tài)。

1.1.6 外傷血瘀 《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“若有所墮墜，惡疝，惡血，在內(nèi)而不去，……則氣血凝結(jié)”。外傷可致血脈受損，血液溢于脈外而為血瘀。華興邦等[14]將雄性家兔固定在兔臺(tái)上，用杠桿壓力器在右后肢體大腿內(nèi)側(cè)肌肉加壓75 kg，持續(xù)1.5 h，然后通過(guò)測(cè)定肌溫、腿徑、血流量、血液流變學(xué)、病理學(xué)檢查成功復(fù)制了外傷血瘀證動(dòng)物模型。

1.1.7 熱毒血瘀 《讀醫(yī)隨筆》云：“血猶舟也，津液者水也?！睙嵝耙讉蛞海陆蛞翰蛔悴荒茌d血運(yùn)行；另血受熏蒸，易瘀塞凝結(jié)而致血瘀。卞慧敏等[15]分別采用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌內(nèi)毒素、地塞米松加內(nèi)毒素3種方法復(fù)制“熱毒血瘀”證候模型，3種方法在血凝學(xué)指標(biāo)中均表現(xiàn)為凝血酶原時(shí)間(PT)、部分激活的凝血活酶時(shí)間(KPTT)顯著縮短，但在血液流變學(xué)指標(biāo)中則各有不同。

1.1.8 血虛血瘀(脾虛血瘀) 《景岳全書(shū)》云：“凡人之氣血猶源原也，盛則流暢，少則雍滯。”“氣為血之帥，血為氣之母?！毖摽芍職馓?，氣虛又可致血瘀。常復(fù)蓉等[16]將家兔股動(dòng)脈放血造成急性失血，放血后24 h、72 h、120 h，3次復(fù)測(cè)血常規(guī)及凝血、血液流變學(xué)、球結(jié)膜微循環(huán)、股動(dòng)脈血流量、光電容積圖波幅、阻抗血流圖波幅、超氧化物歧化酶(SOD)、去甲腎上腺素(NE)、血栓素B2(TXB2)、病理形態(tài)學(xué)等指標(biāo)，成功復(fù)制血虛血瘀模型。

1.1.9 陰虛血瘀 《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》：“陰虛之甚者，其周身血脈津液，皆就黏稠?！标幗蚝膫療o(wú)源，脈道空虛，血行不利而生瘀；陰虛生內(nèi)熱，血熱則聚而成瘀。葉宏軍等[17]采取氫化可的松聯(lián)合腎上腺素建立陰虛血瘀大鼠模型，并予六味地黃湯灌胃，末次給藥后1.5 h頸動(dòng)脈放血檢測(cè)血液流變學(xué)的改變，成功建立了陰虛血瘀證動(dòng)物模型。

1.1.10 自然衰老血瘀證 《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“六十歲，心氣始衰，苦憂悲，血?dú)庑付琛！彪S著年齡增長(zhǎng)，機(jī)體老化，血液運(yùn)行遲緩。趙瑛等[18]通過(guò)觀察對(duì)比老年雄性大鼠與對(duì)照組在體重、體溫、疲勞時(shí)間、自主活動(dòng)、血液流變學(xué)等指標(biāo)上的差異，結(jié)果顯示，老年雄性大鼠可以作為慢性天然氣虛血瘀模型。

1.2 依據(jù)病理制備動(dòng)物模型 近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥“活血化瘀”熱，在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)某些病理狀態(tài)有典型的血瘀證的癥狀和體征，目前常用的血瘀證動(dòng)物模型主要依據(jù)血流動(dòng)力學(xué)的障礙、微循環(huán)障礙、血液流變異常、血管灌注區(qū)缺血和血栓形成以及血管壁損傷等。梁愛(ài)華等[19]通過(guò)將細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)與角叉菜膠(Ca)復(fù)合因素制備模型，造模后24 h觀察血栓形成，并于造模后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批觀察血液流變學(xué)指標(biāo)、微循環(huán)變化、凝血及炎癥反應(yīng)指標(biāo)的變化，成功建立血瘀證動(dòng)物模型。卞慧敏等[20]將大鼠每日皮下注射D -半乳糖48 mg/kg，第32天開(kāi)始再予地塞米松1.5 mg/kg肌肉注射，第40天腹腔注射呋塞米1.8 mg/kg。并觀察六味地黃湯對(duì)血液流變學(xué)的影響復(fù)制了衰老加陰虛血瘀證動(dòng)物模型。張?jiān)蕩X等[21]予改良Z -longa線栓法復(fù)合多因素刺激復(fù)制氣滯血瘀證模型，觀察模型在表征、舌象、腦組織形態(tài)學(xué)及血液流變學(xué)等指標(biāo)的變化，建立了氣虛血瘀證模型的評(píng)價(jià)體系。王婷婷等[22]采用注射腎上腺素加聲光電、冰水浴、束縛、夾尾的方法復(fù)制氣虛血瘀證大鼠模型，并采用MOTO壓力傳感技術(shù)檢測(cè)血液流變學(xué)，采取凝固法檢測(cè)凝血四項(xiàng)。王洪復(fù)等[23]將家兔接受丙線照射后出現(xiàn)微循環(huán)障礙，并采用芪甲丹注射液反治能改善微循環(huán)。王健等[24]于家兔耳緣靜脈注射10%高分子右旋糖酐，每周2次，連續(xù)10周復(fù)制血瘀證動(dòng)物模型，引起家兔血流速度增快，部分血流停止，眼球結(jié)膜微循環(huán)變化，微小靜脈擴(kuò)張，微血管周?chē)鷿B出，血液流變學(xué)明顯改變等變化。

1.3 病證結(jié)合模型 病證結(jié)合模型有西醫(yī)疾患的病理生理特點(diǎn)，同時(shí)又有中醫(yī)證候的癥狀和表征，是微觀和宏觀的結(jié)合，是實(shí)驗(yàn)研究及臨床實(shí)驗(yàn)的重要載體。谷萬(wàn)里等[25]將大鼠置于籠內(nèi)，放置于-5 ℃±1 ℃的可調(diào)溫冰箱中，連續(xù)3 h，使大鼠充分暴露于低溫環(huán)境中，再恢復(fù)20 ℃±1 ℃室溫，并腹腔注射垂體后葉素20 U/(kg·d)，連續(xù)3 d，通過(guò)對(duì)比造模前后的外觀、肛溫、耳溫、心電圖、心臟病理學(xué)檢查以及血清游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)、內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)等指標(biāo)的變化成功建立了寒凝血瘀心肌缺血病證結(jié)合模型。周海哲等[26]采用高脂乳劑1 mL/100 g灌胃，并地塞米松1.5 mg/kg后肢外側(cè)肌注，持續(xù)10 d，隨即行雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，通過(guò)對(duì)比大鼠行為學(xué)、大腦組織中生長(zhǎng)抑素(SS)含量，復(fù)制了痰瘀互結(jié)血管性癡呆模型。劉丹彤等[27]通過(guò)自體內(nèi)膜移植法建立了子宮內(nèi)膜異位癥模型，然后予情志刺激、食用油1 mL/100 g灌胃，并腎上腺素皮下注射，每只0.2 mL，每周1次。隨后觀察模型行為學(xué)表現(xiàn)及外部體征、組織形態(tài)學(xué)、單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)、血管內(nèi)皮因子的變化，證明通過(guò)多因素整合成功建立了子宮內(nèi)膜異位癥氣滯血瘀證模型。張明雪等[28]采用高脂飲食、皮下注射垂體后葉素以及寒冷刺激多因素造模，然后進(jìn)行心電圖、心臟彩超、心肌酶、血小板、血脂等檢查，成功復(fù)制冠心病(心)陽(yáng)虛血瘀證候模型。聶金濤[29]采取將SD大鼠術(shù)前禁食24 h，麻醉后頸部正中切口，分離肌肉和組織后將雙側(cè)頸總動(dòng)脈用4號(hào)絲線結(jié)扎，縫合后傷口局部注射慶大霉素2 000 U預(yù)防感染，并用補(bǔ)腎活血方反證，成功建立血管性癡呆血瘀證大鼠模型。李海霖等[30]將大鼠放置于真空干燥箱內(nèi)，模擬高原低壓缺氧狀態(tài)，每日3.5 h，此后放置于冰箱中予寒冷刺激3.5 h，共35 d。在此過(guò)程中一次性腹腔注射50 mg/kg體重的鏈脲佐菌素。成模后定時(shí)檢測(cè)血糖，并比較大鼠飲水量、進(jìn)食量、體重、糖化血紅蛋白、血糖、尿微量白蛋白、肌酐、尿素氮、腎臟肥大指數(shù)的差別，成功建立了高原陽(yáng)虛血瘀證糖尿病腎病動(dòng)物模型。

2 存在問(wèn)題及思考

當(dāng)前中醫(yī)證候模型制備的主要思路包括病因、病理、病因病理結(jié)合模型和病證結(jié)合模型，而病證結(jié)合模型最具實(shí)用價(jià)值。近年來(lái)隨著研究的逐步深入，血瘀證動(dòng)物模型不斷充實(shí)和改進(jìn)，但同時(shí)也暴露出一些問(wèn)題。

2.1 優(yōu)化造模因素，多因素復(fù)合造模 中醫(yī)學(xué)的辨證綱領(lǐng)、論治原則、治法、方劑共同構(gòu)成了中醫(yī)臨床實(shí)踐的辨證論治體系。而“證候”則是這個(gè)體系中的關(guān)鍵。依據(jù)中醫(yī)學(xué)“有諸內(nèi)必行諸于外”的整體觀念，證候模型是利用動(dòng)物某些生物表征來(lái)模擬人體證候特征的一類(lèi)生物表征模型。目前，模型評(píng)價(jià)指標(biāo)有以病因?yàn)檎J(rèn)定依據(jù)，有以體征或行為作為評(píng)判指標(biāo)，有學(xué)者強(qiáng)調(diào)以類(lèi)血瘀的病理生理指標(biāo)為依據(jù)，也有以方藥的反證為依據(jù)。成功建立動(dòng)物模型應(yīng)滿足3個(gè)條件：①模型與原型有相似關(guān)系；②模型在致病機(jī)制、病理表現(xiàn)方面能替代原型；③模型的研究應(yīng)能得出原型的信息。多因素復(fù)合造模，由于既符合血瘀證的診斷標(biāo)準(zhǔn)，也有公認(rèn)的病理生理指標(biāo)來(lái)支持，應(yīng)成為制備血瘀證候模型的重要研究方向。

2.2 完善血瘀證模型判斷標(biāo)準(zhǔn) 血瘀證覆蓋范圍很廣，內(nèi)科、外科、婦科、五官科、骨傷科各科疾病都可出現(xiàn)血瘀的病理改變，2011年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專(zhuān)業(yè)委員會(huì)制定《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療指南》。但在造模過(guò)程中，因?yàn)閯?dòng)物種屬差別、制作技術(shù)水平的差異、氣候環(huán)境等主客觀因素的影響，目前血瘀證模型制備缺乏規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)。隨著動(dòng)物模型表征的研究，急需完善科學(xué)統(tǒng)一的血瘀證模型判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 深化病證結(jié)合模型研究 血瘀證動(dòng)物模型的研究目的是為臨床或藥物開(kāi)發(fā)提供支持。多數(shù)血瘀證模型是依據(jù)中醫(yī)血瘀證的病因病機(jī)或西醫(yī)的病理生理而建立的，模型的實(shí)用性、針對(duì)性不足。而病證結(jié)合綜合考慮了中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)和西醫(yī)病理特點(diǎn)，符合病證結(jié)合研究趨勢(shì)，臨床意義更大。但當(dāng)前血瘀證病證結(jié)合模型研制緩慢，尚需深入研究。

2.4 重視對(duì)自發(fā)性血瘀證模型的研制 病理性或藥物干預(yù)性血瘀證候模型雖然部分可模擬中醫(yī)血瘀特點(diǎn)，但是在形成機(jī)制、動(dòng)物表征方面，與人類(lèi)血瘀證形成差距較大。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，充分利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特點(diǎn)，通過(guò)合理的培育手段，可嘗試建立自發(fā)性血瘀證動(dòng)物模型，對(duì)血瘀證研究具有較大價(jià)值。