幾種鯉科魚類骨骼標(biāo)本的制作方法總結(jié)

（河南師范大學(xué),水產(chǎn)學(xué)院，河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)動(dòng)物疾病控制河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007）

魚類骨骼埋藏在肌肉中，起到維持魚類體型并保護(hù)內(nèi)臟器官的作用，其形態(tài)、骨骼之間的關(guān)系相對(duì)固定，不易受外界環(huán)境的影響，因此骨骼標(biāo)本在研究魚類的形態(tài)特征演化趨勢(shì)、對(duì)生境的適應(yīng)性及分類地位的確定具有重要作用[1-2]。同時(shí)，骨骼標(biāo)本能夠提供直觀、真實(shí)的形態(tài)學(xué)素材，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中也具有重大意義，也可以用于陳列和展覽[3-4]。現(xiàn)有文獻(xiàn)中有很多關(guān)于骨骼標(biāo)本制作的研究，大體可分為兩類：一類是透明骨骼的制作方法，即利用物理和化學(xué)方法使軟組織和透明劑的折光率相近從而使軟組織透明，骨組織和特殊處理的組織由于染色而被顯現(xiàn)[5-6]。另一類是利用物理和化學(xué)方法或生物學(xué)方法去除肌肉保留完整骨骼的方法。此類方法還可細(xì)分為三種：一是熱剔法[7]，二是冷剔法[8-11]，三是生物學(xué)方法[12-14]。此類方法肌肉剔除方法難以掌握，雖關(guān)于研究第二類方法的文獻(xiàn)很多，但都存在剔除肌肉步驟敘述不詳細(xì)的缺點(diǎn)[7-11]，并且對(duì)于某些較難處理部位，如咽顱并未進(jìn)一步詳細(xì)敘述，給初學(xué)者造成了很大的不便。為制作用于本科教學(xué)的魚類骨骼標(biāo)本，通過對(duì)多次來源于新鮮標(biāo)本及甲醛固定標(biāo)本的鯉科魚類標(biāo)本骨骼制作摸索，本文總結(jié)出一套較為詳細(xì)、簡(jiǎn)便的骨骼標(biāo)本制作方法，以期對(duì)鯉科魚類骨骼標(biāo)本的制作具有參考價(jià)值。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮鯽、鯉、草魚，體型正常，體重分別為0.5 kg(鯽)、3.5～4 kg（鯉），4～5 kg（草魚）。 購(gòu)自新鄉(xiāng)市北環(huán)水產(chǎn)市場(chǎng)。甲醛固定標(biāo)本拉氏大吻鱥Rhynchocypris lagowskii、尖頭大吻鱥 Rhynchocypris oxycephalus，體型正常，體長(zhǎng) 115～130 mm，體重 20～45 g，采自太行山區(qū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

解剖刀、手術(shù)剪刀、手術(shù)鑷子、解剖針、漂骨缸等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

0.5%～1%的NaOH溶液（質(zhì)量-體積濃度）、95%的乙醇溶液（體積百分濃度）、3%～5%的H2O2（體積百分濃度）。

2 制作方法

2.1 標(biāo)本清洗

2.1.1 甲醛標(biāo)本

將甲醛固定標(biāo)本用流水沖洗，直到無刺激性氣味為止。

2.1.2 新鮮標(biāo)本

將新鮮標(biāo)本表面污漬用水清洗干凈，體表粘液用毛巾擦拭去除。

2.2 生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定

對(duì)甲醛標(biāo)本及新鮮標(biāo)本進(jìn)行生物學(xué)指標(biāo)測(cè)量，測(cè)量其體重、體長(zhǎng)、全長(zhǎng)等，做好記錄，以便估算試劑用量和評(píng)估制作效果。

2.3 皮膚剝離、內(nèi)臟去除

2.3.1 甲醛標(biāo)本

從實(shí)驗(yàn)魚背部中間枕骨大孔處向尾鰭方向用解剖刀輕輕劃開皮膚，注意避開背鰭，再在各鰭處緊貼著魚鰭四周劃開皮膚，然后用鑷子和解剖刀從背部向腹部、頭部向尾部剝離皮膚，剝到各鰭處時(shí)需小心剝離。之后，將腹鰭及其腰帶一同剪下，待后期處理。然后沿腹部正中線剪開至肩帶后1 cm左右，清除全部?jī)?nèi)臟，用水沖洗干凈。

2.3.2 新鮮標(biāo)本

活魚需要做窒息處理，之后將魚鱗用刀刮掉，用毛巾擦凈魚體表面粘液，然后進(jìn)行皮膚剝離、內(nèi)臟去除，方法同2.3.1。

2.4 取咽顱

甲醛標(biāo)本與新鮮標(biāo)本取咽顱步驟相同，步驟如下：沿著下頜中線和鰓蓋邊緣將各連接處結(jié)締組織剪開，將基舌骨暴露，因舌弓不易被發(fā)現(xiàn)，用鑷子將基舌骨向上撬起直到露出兩側(cè)的下舌骨，即可發(fā)現(xiàn)有鰓條骨通過系膜與其相連，用鑷子將系膜與其分離，分離后將下舌骨、角舌骨表面的系膜剝離，即可發(fā)現(xiàn)角舌骨與莖舌骨連接處與鰓蓋內(nèi)側(cè)一凹窩形成關(guān)節(jié)并通過系膜相連，將此處內(nèi)外系膜與鰓蓋分離即可將舌弓與鰓蓋連接處完全分開。尾舌骨埋藏于峽部與喉部，將此處肌肉用鑷子輕輕剝離將尾舌骨暴露后，沿尾舌骨邊緣將喉部剪斷，喉部?jī)?nèi)側(cè)仍有肌肉與咽顱相連，將其與咽顱分離。肩帶上的匙骨內(nèi)側(cè)與咽顱的咽骨有肌肉相連，將其匙骨內(nèi)側(cè)肌肉剪斷后咽顱上部已可游離。再次將基舌骨向上撬起，可發(fā)現(xiàn)其腹面的口咽腔底壁，將其全部清除，即可發(fā)現(xiàn)咽鰓骨附在角質(zhì)墊周圍，將咽鰓骨從角質(zhì)墊附近輕輕分離，甲醛樣本分離時(shí)，因角質(zhì)墊極易脫落，需小心分離，分離后咽顱兩側(cè)仍有肌肉相連，再將其剪斷，至此咽顱底部也可游離，然后將咽顱取出待后期處理。

2.5 粗剔

2.5.1 甲醛標(biāo)本

先從背部剔除體側(cè)表層大側(cè)肌直到暴露肋骨，然后再剔除肋骨處肌肉。肋骨處肌肉按照肋骨方向用鑷子撕下，肋骨基部的肌肉較容易剔除，盡量將其去除干凈。其它部分按照肌肉的紋理方向或反其方向剝離肌肉，除肋骨基部肌肉不易剔下其它處肌肉較易剔除，粗剔時(shí)即可完全剔除，髓棘和脈棘間僅剩系膜相連。脊柱兩側(cè)的肌肉豎直向下或向上即可將脊椎上肌肉完全剔除，處理時(shí)盡可能按照肌肉紋理走向，注意用力得當(dāng)，盡量整塊剔除肌肉。將不和脊柱相連的肌間骨一并去掉，各鰭及其支鰭骨先不處理，待細(xì)剔時(shí)處理。注意開始剝離肉后不要使肌肉沾水，否則會(huì)增加剔除難度。

2.5.2 新鮮標(biāo)本

先從背部剔除體側(cè)表層大側(cè)肌直到暴露肋骨，然后再剔除肋骨處肌肉。沿著脊柱輕輕將肌肉劃開成兩部分。肋骨表面肌肉順其肋骨方向用鑷子輕輕撕下，粗剔時(shí)肋骨游離端肌肉剔除得越薄越好。新鮮標(biāo)本肋骨特別前兩根肋骨極易與脊柱分離，肋骨基部肌肉先輕輕剔除薄薄一層即可，剔除時(shí)應(yīng)十分小心。剔除其它部分肌肉先用解剖刀豎直劃開幾道，然后用鑷子沿著劃開的刀口豎直向下或向上大塊剝離肌肉即可清晰看見脈棘和髓棘。

2.6 細(xì)剔

2.6.1 甲醛標(biāo)本

繼續(xù)將肋骨上的肌肉用鑷子或解剖刀將其剔薄，將各肋骨間的肌肉剔除，或用剪刀剪開，分開后單獨(dú)處理每根肋骨。單獨(dú)處理一根肋骨時(shí)用兩把鑷子，一把夾住肋骨基部一側(cè)，另一把從該處夾住肋骨向游離端輕輕剝離肌肉，剝離到最后1 cm處因其逐漸變細(xì)游離端肋骨容易斷裂，可先將剝離下的肌肉與肋骨分離，再用兩把鑷子按照上述方法將最后的肌肉去掉。此外也可夾住肋骨游離端向上1 cm處然后用鑷子向上剝離，最后1 cm處順著肋骨方向參照上述方法處理。按照實(shí)際情況選其中一種即可將所有肋骨處理干凈，處理由16-20枚脊柱的肋骨時(shí)，因其更加細(xì)小，剔除肌肉時(shí)要更加小心。

2.6.2 新鮮標(biāo)本

新鮮標(biāo)本肋骨處剔除方法基本相似，但新鮮標(biāo)本肋骨處肌肉順肋骨方向較易清除，反肋骨方向不易清除。新鮮標(biāo)本較大，肋骨較長(zhǎng)，用兩把鑷子剔除肌肉時(shí)，鑷子相離較近時(shí)方便用力，且不易將肋骨折斷。除肋骨處的其余肌肉，先后使用解剖刀、鑷子順?biāo)杓?、脈棘方向?qū)⑷饴蕹?，至此髓棘與脈棘處僅剩薄薄的一層系膜。

2.7 處理頭部、魚鰭及其支鰭骨

新鮮標(biāo)本與甲醛固定標(biāo)本處理方法相同，處理方法如下：將眼窩內(nèi)充斥的內(nèi)含物仔細(xì)清除。在眼腹面鰓區(qū)前有一月牙形肌肉覆蓋在皮膚和前鰓蓋骨之間即下頜收肌，沿肌肉下邊緣將皮膚劃開，將其底部肌肉剔除干凈。因圍眶骨系骨片較小容易被破壞，因此保留此處皮膚，不予剝離。除此處皮膚外需將頭部其它部分皮膚全部剝離，上下頜部分骨骼細(xì)小，剔除時(shí)應(yīng)多加小心。鰓蓋骨后方肌肉較易清除，將此處肌肉清除后再將腦顱內(nèi)含物用水沖洗干凈，若沖洗不掉再用鑷子小心剔除，頭部骨骼即清理完成。處理胸鰭及肩帶時(shí)，肌肉較易清除，但需小心不要將兩肩帶連接處弄斷。臀鰭以及背鰭支鰭骨處的肌肉按照支鰭骨著生方向先用鑷子剝離大塊肌肉，不易用鑷子剔除部分再用解剖針仔細(xì)剔除，保留較薄結(jié)締組織層保持連接即可。尾鰭部尾桿骨肌肉較易去除，參照上述支鰭骨處肌肉剔除方法小心剔除即可。

2.8 處理咽顱及腹鰭、腰帶

2.8.1 甲醛標(biāo)本

咽顱先用水清洗干凈血污與食物殘?jiān)?。首先用鑷子將鰓絲從鰓弓上剝離，甲醛標(biāo)本鰓絲較易剝離。若咽顱背部有口腔頂壁覆蓋，首先將口腔頂壁從上向下剝離至第四基鰓骨后端，再沿著咽鰓骨向上鰓骨處剝離，剝離過上鰓骨和角鰓骨連接處，接著再?gòu)纳舷蛳氯コ?，甲醛固定引起?biāo)本組織皺縮，故口腔頂壁與鰓弓緊密相連不易清除。因此處極易破壞鰓弓，需小心剝離。位于第五對(duì)左右角鰓骨和下咽骨之間有一大片扁平的肌肉即腹面后橫肌和食道前端，用剪刀鑷子將此處肌肉分離后即可暴露咽齒。然后處理咽齒，咽齒處肌肉用鑷子沿著咽齒著生方向剝離，雖咽齒較堅(jiān)固但也要小心處理,防止處理不當(dāng)造成咽齒脫落。口腔頂壁去除后，基鰓骨與下鰓骨表面仍有口腔底皮和細(xì)小肌肉覆蓋，因口腔底皮皺縮后與肌肉、骨骼緊密相連，且此處骨骼細(xì)小，需用小號(hào)鑷子小心去除，第五對(duì)鰓弓借韌帶連接于第四基鰓骨后端，去除時(shí)為保證咽顱的完整性，此處肌肉不剔除。咽鰓骨內(nèi)外表面仍有細(xì)小肌肉，需用小號(hào)鑷子小心剔除，至此咽顱已處理完成。腰帶處肌肉較易處理，沿肌肉纖維走向小心剝離處理，保留腰帶骨骼即可。

2.8.2 新鮮樣本

咽顱先用水清洗干凈血污與食物殘?jiān)?。新鮮標(biāo)本的鰓絲柔軟，處理鰓絲時(shí)需一把鑷子夾住鰓弓，再用另一把鑷子一點(diǎn)一點(diǎn)的將鰓絲剝離。因新鮮標(biāo)本口腔底壁較柔軟未皺縮，取咽顱時(shí)即可清理干凈，若未清除干凈用鑷子小心剝離即可。其它部分處理方法參照甲醛標(biāo)本處理方法。但處理咽齒時(shí)，因新鮮魚肌肉具有粘性，咽齒間肌肉不易去除，咽齒間的肌肉則需用解剖針逐一剔除，此處未剔除干凈的肌肉，可用NaOH溶液浸泡腐蝕后再進(jìn)一步剔除。

2.9 腐蝕肌肉

后續(xù)步驟中新鮮標(biāo)本與甲醛固定標(biāo)本處理過程一致。將剔過的標(biāo)本浸入0.5%～1%的NaOH溶液中，浸泡10～12 h，處理時(shí)間根據(jù)魚體大小做適當(dāng)調(diào)整，浸泡期間需定期檢查骨骼之間連接狀態(tài)，防止浸泡過度造成骨骼間結(jié)締組織被腐蝕變成散骨。浸泡結(jié)束后用清水輕輕沖去殘留NaOH溶液，NaOH溶液沖洗干凈后若仍有未剔除干凈肌肉可再次剔除。在細(xì)剔時(shí)保留的棘間系膜經(jīng)NaOH溶液腐蝕后變得透明柔軟，用鑷子小心剔除即可。

2.10 脫脂

將用NaOH溶液處理過的骨骼放入已準(zhǔn)備好的95%的乙醇溶液中浸泡30 min，根據(jù)實(shí)際情況時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)直至骨骼標(biāo)本表面無殘留油脂。

2.11 漂白

放入盛有3%-5%H2O2溶液的漂骨缸內(nèi)，直到骨骼透明為止。因H2O2溶液具有氧化性，至骨骼變白時(shí)需及時(shí)將其拿出，否則會(huì)使骨骼軟化甚至散架。腐蝕肌肉、脫脂、漂白三個(gè)過程均將骨骼標(biāo)本自然放置，避免使其彎曲。

2.12 整形裝架

漂白后將骨骼拿出，若骨骼彎曲，取長(zhǎng)度大于骨骼總長(zhǎng)1/3的光滑直徑適宜的木棍，將木棍穿過其口并用尼龍線將其固定在魚的脊柱處，使脊柱呈自然的狀態(tài)。待骨骼干燥后，置于骨架臺(tái)上即可。

3 結(jié)果及其討論

甲醛固定標(biāo)本與新鮮標(biāo)本的骨骼標(biāo)本制作各有優(yōu)缺點(diǎn)。甲醛固定標(biāo)本肌肉、鰓絲較易剔除，但因被甲醛浸泡過，骨骼變得硬，柔韌性變差，在取咽顱時(shí)極易使鰓條骨斷裂，因此取咽顱時(shí)需細(xì)致小心，同時(shí)甲醛標(biāo)本口腔底壁因皺縮不易去除極易破壞鰓弓。新鮮標(biāo)本肌肉、鰓絲因新鮮具粘性剔除較甲醛固定標(biāo)本難度稍有增大，但因其骨骼靈活性大，取咽顱時(shí)不易損壞其它部位。同時(shí)，在骨骼標(biāo)本制作完成后，從外觀形態(tài)而言，新鮮標(biāo)本更為美觀。本文采用的方法較透明骨骼的制作方法相比，透明骨骼的制作方法可以在保持標(biāo)本外形完整的情況下顯示出體內(nèi)骨骼部分,顯示出生物體的骨骼發(fā)育情況[6]，但存在耗時(shí)久、耗材多、褪色步驟難以掌握、易受實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、動(dòng)物體質(zhì)量、動(dòng)物年齡和堿性試劑濃度等因素影響等缺點(diǎn)[15-18]。本文采用的方法用時(shí)短且容易控制、耗材少，標(biāo)本更加清晰美觀。與同類方法中的熱剔法而言，處理時(shí)間較易控制，熱剔法中時(shí)間難以控制，時(shí)間較長(zhǎng)骨骼容易散架，時(shí)間較短肌肉組織較難剝離，且高溫會(huì)使鰭條間的蛋白質(zhì)變性，各骨骼間相連的韌帶將被破壞而易變?yōu)樯⒐?，魚類骨骼數(shù)目多且骨片小，散架后人為連接很難成功[10]。而本實(shí)驗(yàn)采用的方法各鰭條及支鰭骨可保存完好。本實(shí)驗(yàn)較生物法能夠人為控制，且實(shí)驗(yàn)時(shí)間不受限制，生物法利用生物啃食肌肉的方法，存在骨骼易被誤食、耗時(shí)時(shí)間無法控制、制作時(shí)間受受試生物影響、骨骼標(biāo)本不美觀等缺點(diǎn)[12-14]。但本實(shí)驗(yàn)剔除肌肉需熟練掌握后才能制作出較理想的標(biāo)本更加行之有效的方法需進(jìn)一步摸索。

[1]陳曉峰.兩種石斑魚骨骼系統(tǒng)比較解剖研究[D].廈門:廈門大學(xué),2007.

[2]蘇懷棟，陳圓圓，龍微鑫，等.多種魚類骨骼標(biāo)本制作[J].河北漁業(yè),2012(7):55-57.

[3]關(guān)梅,楊興,李建光,等.鱘魚剝制標(biāo)本的制作[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(6):88-89.

[4]白鳳熙.魚透明骨骼標(biāo)本的制作方法[J].科技信息，2012(2):128-128.

[5]劉萬祥,蔡瀅,王長(zhǎng)月.骨骼透明標(biāo)本制作及應(yīng)用[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,8(3):377-378.

[6]王繼芳,周凡,曹榮峰.整體顯示小鼠骨骼標(biāo)本的制作試驗(yàn)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)2009,25(13):10-13.

[7]邱奉同.鯽魚骨胳標(biāo)本制作法[J].生物學(xué)教學(xué),1998(9):29-30.

[8]滕斌.做骨胳標(biāo)本的速成方法[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1979(2):89-90.

[9]賈中文,毛世駿,王義民,等.青魚骨骼標(biāo)本制作技術(shù)[J].水產(chǎn)科學(xué),2002,21(1):43-44.

[10]顧勇,吳清理.鯽魚骨骼標(biāo)本的制作[J].生物學(xué)通報(bào),2011,46(7):58-59.

[11]李崢,倫峰,李志軻.匙吻鱘剝制標(biāo)本制作的方法改進(jìn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(15)：114-116.

[12]劉春悅,楊敏,趙立琴,等.用蟲蝕法制作青蛙(蟾蜍)骨骼標(biāo)本[J].生物學(xué)通報(bào),1998(5):48.

[13]李鑫,李萌萌,段星,等.鯉魚骨骼標(biāo)本的制作[J].河套學(xué)院學(xué)報(bào),2016(1).

[14]喻洪志.用水虱“剔”肉法制作魚骨骼標(biāo)本[J].教學(xué)儀器與實(shí)驗(yàn),1993(S1):40-41.

[15]滕斌.透明骨骼標(biāo)本的速成制作方法[J].生物學(xué)雜志,1987(1):25-26.

[16]陳洪貴.骨骼透明標(biāo)本的制作[J].生物學(xué)雜志,1995(6):41-41.

[17]陳彬,王躍招.介紹一種透明骨骼標(biāo)本染色法[J].生物學(xué)通報(bào),2002,37(4):57-57.

[18]臺(tái)紅祥,王兆龍,高衛(wèi)真,等.動(dòng)物骨骼透明標(biāo)本制作方法的改進(jìn)[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,20(6):494-495.