淇河鯽的胚胎發(fā)生觀察

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

淇河鯽（Carassius auratus in Qihe river），屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鯽屬（Carassius），原產(chǎn)于河南鶴壁地區(qū)的淇河中下游，故稱為淇河鯽。是“淇河三珍”之一，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。與普通鯽相比，淇河鯽形態(tài)明顯不同，其特點(diǎn)為脊背寬厚，厚度可雙倍于普通鯽魚，體形飽滿，又稱為“雙脊魚”。因其是三倍體魚類，具備快速生長、個(gè)大體壯的優(yōu)良性狀。作為天然雌核發(fā)育的種群，淇河鯽具有穩(wěn)定的遺傳性能[1-4]，由于易繁殖、疾病少等優(yōu)點(diǎn)，深得人們青睞，因而池塘養(yǎng)殖規(guī)模得以迅速發(fā)展[5-8]。淇河鯽風(fēng)味鮮美，營養(yǎng)成分豐富，更有“以其食魚，唯淇之鯽”的美譽(yù)，使其成為具有廣闊發(fā)展前景的養(yǎng)殖對(duì)象[9]。

因肉嫩味美，營養(yǎng)豐富使淇河鯽被過度捕撈，加之生存環(huán)境的持續(xù)惡化，導(dǎo)致種質(zhì)資源不斷衰退，因此開展淇河鯽的人工繁育技術(shù)就顯得十分必要。此次試驗(yàn)觀察了淇河鯽胚胎發(fā)育全程，為其人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2017年5月從河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)基地取性成熟淇河鯽成魚。雌魚選擇腹部飽滿的個(gè)體，雄魚選擇體質(zhì)強(qiáng)健、鰓蓋粗糙，輕按腹部可擠出精液的個(gè)體[10]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

利用人工催產(chǎn)和干法受精得到受精卵。對(duì)條件良好的親魚胸腔注射催產(chǎn)素人絨毛膜促性腺激素（HCG），注射劑量依據(jù)每千克體重計(jì)算。雌魚注射劑量為1000國際單位，雄魚減量一半。使用時(shí)將激素充分溶解于生理鹽水，擦干注射部位水分后，用70%酒精消毒后進(jìn)行激素注射。注射完成后放入暫養(yǎng)池中加以流水刺激，12h內(nèi)留意親魚發(fā)情行為，待其發(fā)情行為顯著后，捕撈親魚并用棉布擦除親魚腹部水漬，將精子和卵子擠入潔凈培養(yǎng)皿中，用手?jǐn)嚢琛_洗后將其置于孵化池孵化，水溫保持在23～25℃[10-11]。

用數(shù)碼體視顯微鏡（OLYMPUS SZ61）對(duì)其胚胎發(fā)育狀況進(jìn)行觀察并拍照，準(zhǔn)確記錄不同時(shí)期典型特征及胚胎發(fā)育時(shí)序。開始發(fā)育的早期每10 min采樣觀察，多細(xì)胞期后每0.5 h采樣觀察，進(jìn)行至第二天則每隔1 h采樣觀察。每次觀察記錄不少于30粒正常發(fā)育的受精卵，依據(jù)該批次中一半以上的受精卵達(dá)到某一發(fā)育時(shí)期的時(shí)間做為該時(shí)期的發(fā)育起始時(shí)間。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

2.1 淇河鯽胚胎發(fā)育時(shí)序

水溫24℃左右，淇河鯽的胚胎發(fā)生全程歷時(shí)約58 h，依次經(jīng)過胚盤形成、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成和孵化出膜7個(gè)階段。依據(jù)其胚胎發(fā)育過程中所呈現(xiàn)的不同外部形態(tài)特性及器官分化情況，發(fā)育歷程還可細(xì)分為23個(gè)發(fā)育時(shí)期（表1）。

表1 淇河鯽的胚胎發(fā)育時(shí)序（24℃）

2.2 胚胎發(fā)育各階段形態(tài)特征

2.2.1 受精卵胚盤形成階段

淇河鯽的卵呈淺黃色，主要為橢圓形和圓球形，粘性卵，卵徑范圍1.5～1.8 mm。受精卵卵膜吸水后其體積膨脹變大，呈透明狀。受精后40 min卵黃周邊原生質(zhì)開始慢慢向動(dòng)物極匯聚，出現(xiàn)一塊顏色加深的突起暗斑，其漸漸向上升起形成胚盤。

2.2.2 卵裂階段

受精后1.33 h進(jìn)行首次卵裂，從胚盤中間開始一分為二形成兩個(gè)等大的分裂球，為經(jīng)裂。此即進(jìn)入2細(xì)胞期。約25 min后觀察到第二次卵裂，與第一次卵裂所形成的卵裂溝垂直，形成大小一致的四個(gè)卵裂球，此為4細(xì)胞期。胚盤繼續(xù)經(jīng)裂，又經(jīng)過30 min進(jìn)入8細(xì)胞期。第三次卵裂所形成的兩條卵裂溝與第一條卵裂溝平行，生成的八個(gè)分裂球以4×2的形式排成兩列。隨后胚胎陸續(xù)進(jìn)入16細(xì)胞期，分裂球在胚盤上依四行四列的正方形樣式排列。之后經(jīng)過32細(xì)胞期，隨著卵裂持續(xù)進(jìn)行慢慢進(jìn)入多細(xì)胞期。此后分裂球越變越小，層層累積難以觀察，分裂球團(tuán)形如桑葚。

2.2.3 囊胚階段

受精后4 h，層層的細(xì)胞堆積在卵黃上方，細(xì)胞界限不明顯，形成半球形隆起，且隆起高度達(dá)到最高。此時(shí)胚胎發(fā)育至囊胚早期。細(xì)胞持續(xù)分裂，胚盤面積擴(kuò)增但高度開始下降，約50 min后胚體頂部扁平化發(fā)展，發(fā)育至囊胚中期。囊胚繼續(xù)變扁開始緊貼在卵黃上，由于囊壁的細(xì)胞往下生長，慢慢包圍部分卵黃，進(jìn)入“下包”過程。此時(shí)胚胎進(jìn)入囊胚晚期，距離受精已有5.83 h。

2.2.4 原腸胚階段

受精后7.5 h，胚胎囊胚層不斷發(fā)育生長，向植物極下包卵黃，約包住胚體表面的1/2。因部分囊胚層細(xì)胞向胚胎內(nèi)部生長卷曲，在胚盤周邊形成稍厚的胚環(huán)，此時(shí)發(fā)育至原腸早期?？擅黠@觀察到卵黃在有規(guī)律地做伸縮遠(yuǎn)動(dòng)。胚層繼續(xù)下包，1.67 h后約包住胚胎表面的2/3。在胚環(huán)的一定地點(diǎn)，細(xì)胞集中增厚形成胚盾。胚盾開始變大，達(dá)到原腸中期。這一時(shí)期的卵黃動(dòng)態(tài)更為顯著，卵黃變形發(fā)生突起凹陷互換的現(xiàn)象，約80 s一個(gè)循環(huán)。發(fā)育持續(xù)進(jìn)行部分囊胚層細(xì)胞慢慢向胚盾聚集，使其生長變長而延伸到動(dòng)物極頂點(diǎn)。胚層包裹大量卵黃約占其表面的4/5，胚胎發(fā)育進(jìn)行到原腸晚期，距離受精已有10.09 h。

2.2.5 神經(jīng)胚階段

受精后12.59 h，囊胚層細(xì)胞繼續(xù)下包卵黃囊至其底端，仍有少部分卵黃露在胚孔外未被完全包被，形成卵黃栓，胚胎發(fā)育至神經(jīng)胚期。隨著卵黃栓逐漸消失，胚孔逐漸模糊封閉，胚體的輪廓變得逐漸明顯，呈“C”字形貼在卵黃上。胚體的一端也開始變得膨大，胚盾的中部發(fā)育形成神經(jīng)溝。

2.2.6 器官形成階段

受精后14.83 h胚胎發(fā)育進(jìn)入器官形成階段。胚體頭部開始隆起擴(kuò)大，出現(xiàn)團(tuán)塊狀，此時(shí)進(jìn)入腦原基期。17.5 h后胚體頭部兩側(cè)中央形成的突起越來越明顯，后變成囊泡，標(biāo)志著胚胎進(jìn)入視泡期。此時(shí)胚體的尾繼續(xù)隆起，頭部仍透明，距離受精24 h時(shí)發(fā)育進(jìn)程至耳囊期。耳囊在后腦兩側(cè)以小泡狀體呈現(xiàn)，胚體環(huán)繞卵黃一周的5/6以上，大部分卵黃內(nèi)陷。此時(shí)可以觀察到多對(duì)肌節(jié)。受精后25.25 h，胚體尾端開始慢慢與卵黃囊分開，生長發(fā)育呈棒狀，進(jìn)入尾芽期。約再過1.5 h后頭部和尾部與卵黃脫離，胚體可環(huán)繞卵黃一周。頭部眼囊也更加明顯。29.67 h后隨著肌節(jié)數(shù)量增多，可在顯微鏡下觀察到胚體的肌肉在輕微收縮抖動(dòng)，是胚胎進(jìn)入肌肉效應(yīng)期的開始。同時(shí)眼囊周圍開始有黑色素沉著。受精后32 h，可觀察到與頭部接觸的稍后部位心臟在有節(jié)律的跳動(dòng)，進(jìn)入心跳期，約為52次/分鐘。隨后心跳還會(huì)加速，6 h后心臟跳動(dòng)加速至72次/分鐘。此時(shí)期內(nèi)眼部色素積聚越來越多，顏色加深。受精后約35.5 h卵黃逐漸減小內(nèi)陷，尾部搖擺頻率增高。受精后40 h軀體上有均勻分布的黑色斑點(diǎn)，卵黃越來越小，從尾部開始軀干的1/3脫離卵黃。此時(shí)的尾部可來回?cái)[動(dòng)，胚體隨之在卵膜內(nèi)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)。

2.2.7 孵化出膜階段

受精后42 h,胚胎發(fā)育至出膜前期。此時(shí)尾部擺動(dòng)劇烈，軀體的一半脫離卵黃，并可環(huán)繞卵黃一圈多。距離受精后44 h，觀察到頭部后方有略顯紅色的液體流動(dòng)。隨后眼囊完全變黑，卵黃進(jìn)一步縮小，軀體在卵膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)明顯，心跳可達(dá)104次/分鐘。受精后56 h可看到有紅色血液不斷流向心臟，體節(jié)清晰可辨。受精后58 h，卵膜開始破裂，進(jìn)入出膜期。大部分仔魚尾部先出膜。隨后卵膜全部脫落，仔魚孵出。

3 討論

本次觀察結(jié)果顯示，淇河鯽胚胎發(fā)育歷時(shí)約58 h，其中器官形成期最長，約為27.17 h。受精卵胚盤形成階段歷時(shí)最短，大約持續(xù)1.33 h，與大多魚類的胚胎發(fā)育觀察結(jié)果類似，早期胚胎發(fā)育的形態(tài)上無明顯差別[11-21]。但由于遺傳因素的影響，淇河鯽發(fā)育過程仍然表現(xiàn)出特異性，特別是原腸階段觀察到的卵黃伸縮運(yùn)動(dòng)。

與易念等[12]在三倍體鯽魚胚胎（72 h）發(fā)育觀察到的結(jié)果相比，淇河鯽胚胎發(fā)育所需時(shí)間少于三倍體鯽魚，這可能與水溫及卵徑大小有關(guān)，張永泉等[22]及張耀紅等[16]的研究表明，卵徑的大小是影響魚類破膜時(shí)間及積溫的因素之一。溫度是魚類胚胎發(fā)育過程中至關(guān)重要的因素，多數(shù)研究結(jié)果顯示，在適宜的溫度范圍內(nèi)，黃河鯉[11]、唐魚[13]、青鳉[16]及黃河裸裂尻魚[20]等魚類在適當(dāng)?shù)奶岣邷囟葪l件下孵化出膜時(shí)間縮短。溫度是影響發(fā)育速度的主要因素，胚胎發(fā)育每一階段的完成都需要一定熱量，此熱量用該時(shí)期的溫度積累值表示，即積溫。這里依照胚胎發(fā)育某階段的積溫（h·℃）=某階段胚胎發(fā)育持續(xù)時(shí)間（h）×水溫均值（℃），其中水溫均值依據(jù)此發(fā)育時(shí)期里多次測量水溫的算術(shù)平均值為準(zhǔn)。計(jì)算出淇河鯽胚胎發(fā)育過程中各個(gè)階段的積溫?cái)?shù)值，各階段數(shù)值之和即是發(fā)育所需的總積溫。結(jié)果顯示從受精卵胚盤形成階段到孵化出膜階段的積溫依次為31.26 h·℃，64.16 h·℃，84.95 h·℃，126.59 h·℃，56 h·℃，680.61 h·℃，396 h·℃，其中器官形成期的積溫?cái)?shù)值最大，達(dá)到總積溫值的47.28%。完成整個(gè)發(fā)育全程所需的總積溫為 1439.57 h·℃。

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