食用菌菌種保藏方法的研究進(jìn)展*

劉遠(yuǎn)超，梁曉薇，莫偉鵬，卓麗君，胡惠萍**，黃龍花，謝意珍，2

（1．廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2．廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

食用菌營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特且功效顯著，隨著生活水平的提高，人們對食用菌的需求量日益增加。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO） 統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]顯示，2016年我國食用菌總產(chǎn)量780萬t，占全球總產(chǎn)量的70%以上，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中位居第五[2]，僅次于糧、油、菜、果。食用菌產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展離不開優(yōu)質(zhì)的食用菌菌種，菌種作為生產(chǎn)的源頭，其質(zhì)量好壞直接關(guān)系到產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)[3－4]。食用菌菌種業(yè)中有句俗話：收多收少在于種 （zhòng），有收無收在于種（zhǒng）。這充分說明了優(yōu)質(zhì)菌種在食用菌產(chǎn)業(yè)中的決定性作用，是食用菌產(chǎn)業(yè)能否正常運(yùn)行的物質(zhì)基礎(chǔ)。菌種選育和菌種保藏都是優(yōu)質(zhì)菌種研究的核心，雖然我國科技人員在菌種選育方面做了大量工作，但目前菌種保藏的研究基礎(chǔ)還比較薄弱。

1 食用菌菌種保藏方法的基本情況

按照材料可將菌種保藏分為菌絲體保藏和孢子保藏，食用菌菌種保藏中菌絲體保藏方法應(yīng)用最為普遍，通常通過控制溫度、水分、氧氣、營養(yǎng)因素（培養(yǎng)基組成），降低或者抑制食用菌的生長代謝以達(dá)到菌種保藏的目的[5-6]。按照環(huán)境調(diào)控可將菌種保藏方法分為：控制含水量的有冷凍干燥保藏法、控制氧氣的有礦油保藏法、無菌蒸餾水和鹽水保藏法[6-8]，控制溫度最為常用的是繼代培養(yǎng)低溫保藏法和超低溫（液氮）保藏法。從現(xiàn)有的研究成果和實(shí)踐應(yīng)用來看[9]，短期菌種保藏使用最為廣泛的是繼代培養(yǎng)低溫保藏法，即在繼代培養(yǎng)后室溫存放1個～2個月或者冰箱（5℃～8℃） 存放3個～4個月，此類方法需要頻繁的轉(zhuǎn)接，因此易被污染和退化。長期保藏一般采用超低溫（液氮）保藏法，這種方法保存時間可長達(dá)8年，但缺點(diǎn)是需要專門的設(shè)備且維護(hù)費(fèi)用較高[10]。

評價菌種保藏效果的指標(biāo)繁多，但歸根結(jié)底主要在于如何保持菌種的穩(wěn)定性和防止菌種的退化。菌種保藏目的是要使菌種能夠長期地保持穩(wěn)定而不丟失基因型、表型和生理性狀[11]，而退化是指食用菌的某個或某些性狀突然或緩慢消失且子代不再重復(fù)出現(xiàn)[12]。相關(guān)研究表明，在蟲生真菌中退化的綠僵菌菌絲體扇形區(qū)觀察到強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體DNA改變，涉及脫氧和自我保護(hù)的基因表達(dá)數(shù)量則增多[13]。Chen等[14]用Southern blot分析菌株的核糖體DNA，發(fā)現(xiàn)其退化菌株中缺少輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。Magae等[15]對金針菇的研究發(fā)現(xiàn)正常和退化菌株在添加了溴百里酚藍(lán)和乳糖的液體培養(yǎng)基中會呈現(xiàn)出不同顏色。李丹青等[16]利用SRAP和SCAR分子標(biāo)記技術(shù)分析了正常菌株與其菌絲退化菌株，標(biāo)記了疑似草菇的菌絲退化性狀基因。菌種退化是目前食用菌栽培中普遍存在的現(xiàn)象，原因除了人為原因，如滅菌不充分、選種和培養(yǎng)不細(xì)致等[17]，還有菌種保藏的外界因子和營養(yǎng)成分[18]不合適等原因。

菌種退化原因概括起來主要包括3個方面：一是病毒或細(xì)菌感染菌絲體。Magae等[19]和Qiu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA真菌病毒是引起金針菇和糙皮側(cè)耳菌種退化的1個病原體。Krzysztof[21]也表明MVX病毒在多個歐洲國家引起雙孢蘑菇子實(shí)體畸形等退化現(xiàn)象，導(dǎo)致作物損失嚴(yán)重。通過對秀珍菇正常菌株與退化菌株的雙鏈RNA（dsRNA） 病毒檢測，發(fā)現(xiàn)退化菌株可能受dsRNA病毒感染，導(dǎo)致其適應(yīng)環(huán)境能力變?nèi)?，產(chǎn)量降低[22]。研究香菇真菌病毒LeV發(fā)現(xiàn)其能在孢子即有性生殖過程中進(jìn)行垂直傳播，也能在菌絲間進(jìn)行水平傳播[23]。二是遺傳因素[24]。根據(jù)細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)的觀點(diǎn)，細(xì)胞分裂周期越短、生長速度越快的生物，發(fā)生基因突變的可能性就越高。食用菌細(xì)胞分裂和生長速度比動植物更快，因此變異個體存在的幾率大幅增加，造成菌種退化或表觀性狀變化。在退化的草菇菌株中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核不對稱分裂的比例高于正常菌株，胡鋒黎[25]推測這可能是引起草菇菌種退化的重要因素。蛹蟲草交配型基因研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草發(fā)生不形成子實(shí)體的菌種退化現(xiàn)象的原因之一是核相發(fā)生改變，正常菌株為異核體而退化現(xiàn)象菌株為同核體[26]。Horgen等[27]比較雙孢蘑菇正常菌株和退化菌株的DNA和染色體差異，觀察到了染色體丟失、染色體長度多態(tài)性、核糖體DNA重復(fù)序列拷貝數(shù)變化等。三是繼代次數(shù)過多，導(dǎo)致基因突變數(shù)量增加。李曉[28]對黑木耳的繼代和退化關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，菌絲生長速度、分支數(shù)和木屑料分解能力隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而呈現(xiàn)下降趨勢。張政[29]也同樣在退化的草菇菌株中驗(yàn)證了繼代次數(shù)的增加，使β-葡萄糖苷酶和漆酶-1基因表達(dá)量也隨之下降。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌也受繼代次數(shù)的影響，在生產(chǎn)上表現(xiàn)為出菇率下降和單菇重減小，抗雜能力減弱[30]。

環(huán)境因素和培養(yǎng)條件尚可通過改善操作環(huán)境和技能、篩選培養(yǎng)基配方、嚴(yán)格控制培養(yǎng)環(huán)境等方法加以控制，但菌種的繼代是難以避免的，繼代培養(yǎng)保藏法目前依然是研究和生產(chǎn)中常用的菌種保藏方法，但菌種的一些優(yōu)良性狀會逐漸隨著繼代培養(yǎng)帶來的負(fù)向突變而喪失[27，31]。因此，研究人員需要不斷探索穩(wěn)定保藏菌種的方法。

2 國內(nèi)外食用菌菌種保藏方法的研究進(jìn)展

國內(nèi)對食用菌菌種保藏研究起步較晚，研究的種類和試驗(yàn)時間也具有局限性。張婤[32]對547個食用菌菌種開展了無菌蒸餾水4℃冰箱長期保藏的研究，保藏4年后通過纖維素酶活性的檢測，結(jié)果表明總體成活率達(dá)78.87%，但是不同的物種差異較大?，F(xiàn)有保藏方法的研究主要針對一些常見食用菌，如平菇 （Pleurotuso streatus）、金針菇 （Flammulina velutipes）、蛹蟲草（Cordyceps militaris）、雙孢蘑菇（A－garicus bisporus）、香菇 （Lentinula edodes）、羊肚菌（Morchella sp.）、草菇（Volvariella volvacea）、茯苓（Poria cocos）、金福菇（Tricholoma lobayense） 等。

針對平菇菌種的保藏，梁群燾[33]采用梯度降溫和防凍劑對保藏效果開展研究，結(jié)果認(rèn)為液氮保藏效果最佳。韓芹芹[34]對降溫方式、保護(hù)劑、解凍復(fù)蘇3個步驟設(shè)計三因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果認(rèn)為不加保護(hù)劑直接液氮保藏對菌絲體萌發(fā)影響最小。

針對金針菇菌種的保藏，楊慧等[35]對保藏在蒸餾水和液氮中長達(dá)12年的菌種進(jìn)行了萌發(fā)率、生長速度、纖維素酶酶活性和產(chǎn)量的測定，結(jié)果表明2種保藏方法下單瓶產(chǎn)量差異極顯著，認(rèn)為金針菇菌種使用蒸餾水保藏效果更佳。張丹等[36]研究表明金針菇較適宜的短期保藏溫度是20℃，－80℃為理想的中期保藏溫度。

針對蛹蟲草菌種的保藏，林清泉[37]的研究表明退化菌株的脫氫酶酶活性和脫色能力都明顯弱于正常菌株；應(yīng)用RFLP和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)和同工酶分析技術(shù)對正常菌株和退化菌株進(jìn)行分析[38]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)退化菌株較野生馴化菌株發(fā)生了頻率較高的突變，部分同工酶也有明顯變異。何曉紅等[39]認(rèn)為蛹蟲草退化是因?yàn)楹诵透淖?、基因突變、胞?nèi)有害物質(zhì)的積累以及病毒的入侵等，防止退化應(yīng)該從適宜的外界因子包括保藏條件和培養(yǎng)基入手。胡秀彩等[40]也認(rèn)同菌種的退化與培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)接次數(shù)有很大關(guān)系。

針對雙孢蘑菇菌種的保藏，李洪榮[41－42]將常規(guī)保藏與液氮保藏4年的菌種進(jìn)行對比，測定其存活率、生長速度、酶活力，并通過酯酶同工酶電泳以及PAPD分子檢測多個指標(biāo)，結(jié)果表明2種方法間無顯著差異，說明液氮保藏可以長期保持菌種的穩(wěn)定性。

針對香菇菌種的保藏，蔡令儀等[43]以香菇產(chǎn)量為指標(biāo)比較了液氮保藏和4℃冰箱保藏效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液氮保藏的菌種產(chǎn)量更高，但使用前要經(jīng)活化處理。王玉青[44]的研究也證實(shí)液氮保藏對菌種的活力保持效果最好，并提示液氮保藏過程中降溫速度對保藏效果影響很大。

針對羊肚菌菌種的保藏，劉興蓉等[45]認(rèn)為低溫保藏（0～4℃） 的保藏效果要優(yōu)于常規(guī)試管保藏；而侯志江等[46]認(rèn)為較低溫度、有散射光的保藏條件比冰箱保藏的效果更佳。

針對草菇菌種的保藏，陳志宏等[47]認(rèn)為以超低溫液氮保藏效果最好，其次為蒸餾水和礦油保藏，傳代培養(yǎng)保藏效果最差。陳明杰等[48]對草菇菌種添加了10%的甘露醇溶液，發(fā)現(xiàn)溫度4℃保藏的菌種能快速復(fù)活且穩(wěn)定遺傳。

針對茯苓菌種的保藏，邵晨霞等[49]、楊祎等[50]以萌發(fā)情況和生長速度為指標(biāo)評價了斜面、木屑管、液體石蠟3種保藏方法下茯苓菌種5年的保藏效果，結(jié)果表明斜面低溫保藏法適用于短期保藏菌種，液體石蠟保藏法和木屑管保藏法適用于長期保藏。

針對金福菇菌種的保藏，陳志宏等[51]采用了液氮保藏法，從降溫速度和解凍溫度2個方面進(jìn)行優(yōu)化，保藏3個月后，發(fā)現(xiàn)梯度降溫要比直接放進(jìn)液氮保藏效果好，最適解凍溫度為35℃。

針對靈芝菌種的保藏，李鐘慶等[52]對包括靈芝菌種在內(nèi)的161株擔(dān)子菌開展礦油密封保存研究，但結(jié)果顯示此法保藏的靈芝菌種5年以后均失去活力。戴肖東等[53]利用木屑培養(yǎng)基分2批對包括靈芝在內(nèi)的食用菌開展保藏試驗(yàn)，分別在7年和10年后進(jìn)行活性測試，結(jié)果表明采用此方法菌種都可以存活，但同一靈芝菌株存活率為33．3%，因此認(rèn)為木屑培養(yǎng)基適合長期保藏食用菌菌種。研究保護(hù)劑、解凍方式、降溫方法3個因素與靈芝關(guān)系發(fā)現(xiàn)，各因素對靈芝和杏鮑菇菌絲體生長情況、產(chǎn)量、多糖和三萜影響程度均依次為：保護(hù)劑＞解凍方式＞降溫方式[54]。

國外早在20世紀(jì)60年代就已開展真菌的長期液氮保藏研究，Hwang等[55]通過梯度降溫，以10%甘油為保護(hù)劑進(jìn)行液氮保藏，5年后檢測發(fā)現(xiàn)菌絲體仍可存活且未突變。隨著真菌保藏技術(shù)的發(fā)展，逐漸形成系統(tǒng)的液氮保藏操作流程[56－59]。Homolka 等[60－61]使用珍珠巖作為載體，測試不同屬的多種擔(dān)子菌菌種，以生長速度、漆酶和過氧化氫酶為指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果表明該方法下菌種保藏效果與常規(guī)液氮保藏（瓊脂為載體）效果相比具有絕對優(yōu)勢。Morris等[62]對20種真菌（包括擔(dān)子菌、結(jié)合菌和子囊菌）在冷凍和復(fù)蘇時菌絲體的形態(tài)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明大部分擔(dān)子菌、結(jié)合菌和子囊菌菌絲快速冷凍對菌絲體內(nèi)的細(xì)胞影響較小，即便沒有甘油的保護(hù)，冷凍后仍然可以存活，但部分卵菌和擔(dān)子菌則需要甘油作為抗凍劑。Hubalek[63]總結(jié)了之前的微生物冷凍保藏過程的保護(hù)劑研究情況，認(rèn)為保護(hù)劑效果較好的是二甲基亞砜、甲醇、乙二醇、丙二醇等，但是甘油、聚乙二醇、PVP和蔗糖效果較差。Voyron等[64]分別采用6種低溫保藏方法和12種凍干保藏方法對包含靈芝屬真菌在內(nèi)的10種白腐真菌開展研究，以菌絲活力（生長速度、漆酶酶活力和過氧化物酶酶活力）和遺傳穩(wěn)定性（DNA指紋圖譜）為測試指標(biāo)，保藏1個月后，采用6種低溫保藏方法的菌種都可以存活，但是12種凍干保藏方法處理的菌種中，只有2種凍干保藏方法下的菌種存活，遺傳學(xué)分析表明2株靈芝屬真菌冷凍保藏后遺傳物質(zhì)的改變率最高，達(dá)到26%，認(rèn)為凍干保藏不適合靈芝屬真菌的保藏。Veena等[65]以生長速度為指標(biāo)對靈芝菌種的保藏進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明靈芝菌種在高粱培養(yǎng)基上低溫儲藏（5℃～8℃） 可以保持長達(dá)1年的穩(wěn)定且無污染，然而在普通的培養(yǎng)基上低溫保藏卻無法生存。Palacio[66]以生長速度、生物量、多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，對靈芝菌種保藏效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明24℃蒸餾水保藏效果最佳，隨后是－80℃保藏效果，－20℃和冷凍干燥保藏效果最差，這樣的結(jié)果與其他超低溫保藏有差異，可能的原因是在保藏降溫過程中未使用程序降溫儀來控制降溫的速度，導(dǎo)致－80℃保藏效果弱于24℃蒸餾水保藏。

綜上可以得知，國內(nèi)關(guān)于食用菌保藏存在以下問題：對照試驗(yàn)欠缺，保藏時間太短，試驗(yàn)種類不足，試驗(yàn)因子的控制不足，如菌種的菌齡、接種塊的大小、培養(yǎng)基類型等，研究內(nèi)容也十分淺顯。國外關(guān)于菌種保藏特別是液氮超低溫保藏已經(jīng)形成系統(tǒng)性的操作規(guī)程，能夠從菌絲塊大小、菌齡、降溫冷凍和升溫復(fù)蘇的速度、檢測指標(biāo)、防凍保護(hù)劑的類型等方面，開展長時間保藏研究，因此結(jié)果更科學(xué)和實(shí)用。大部分研究者認(rèn)為液氮超低溫保藏效果在所有保藏方式中最佳，適合菌種長期保藏，然而仍存在著問題，例如即便是同一物種的靈芝，不同研究人員使用相似的方法，得出的結(jié)論也不盡相同。

3 分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上的菌種保藏研究趨勢

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，全基因組測序技術(shù)的發(fā)展帶動了菌種保藏在基因?qū)用嫔系难芯?。以靈芝為例，Zhang Xue等[67]研究了熱應(yīng)激對靈芝菌絲體生長的影響，數(shù)據(jù)表明熱應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度顯著增加，因此推斷鈣離子誘導(dǎo)菌絲生長、靈芝酸合成和熱激蛋白的積累，結(jié)果表明鈣離子參與熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)菌絲體生長。Wu Feng-Li等[68]從靈芝中分離得到了可編碼GIPacC的pH響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子PacC/Rim101的同源基因，該基因在中性和堿性條件下高水平轉(zhuǎn)錄，該基因的沉默能夠損害菌絲體對環(huán)境pH的適應(yīng)，且菌絲分支間距增加，導(dǎo)致生長異?；虿∽兌荒苄纬稍妥訉?shí)體，在該基因沉默時，與三萜合成的部分基因表達(dá)上調(diào)，因此推斷GIPacC是一類能夠影響菌絲生長、子實(shí)體發(fā)育和影響三萜合成的復(fù)雜功能基因。

目前，靈芝、香菇、黑木耳等全基因組（細(xì)胞核和線粒體DNA）序列已經(jīng)完成測序[69]，針對菌絲生長階段開展環(huán)境因子對菌絲體代謝的影響機(jī)理研究，在基因?qū)用嬉呀?jīng)成為可能。通過對菌種保藏過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因的發(fā)掘，明晰保藏過程中的生理變化及其機(jī)理，可為科學(xué)、穩(wěn)定、高效地保藏菌種提供理論支持，最終解決菌種保藏中菌種退化的難題。

4 結(jié)語

目前食用菌行業(yè)內(nèi)最為常用的菌種保藏方法是繼代培養(yǎng)低溫保藏法和超低溫（液氮）保藏法。從菌種保藏的研究來看，這兩類方法針對不同的菌株有不同的效果，總體來說短期采用繼代培養(yǎng)低溫保藏法，長期采用超低溫（液氮） 保藏法是可行的，但是需要注意的是在超低溫（液氮）保藏法中要注意程序降溫的方法，尤其是在4℃～-20℃之間，細(xì)胞內(nèi)水分冷凍成冰晶的過程需要采用慢凍的方法。由于液氮保藏在食用菌菌種保藏中應(yīng)用還不太廣泛，所以針對食用菌菌種液氮保藏的研究成果還比較少，需要行業(yè)內(nèi)的科研人員繼續(xù)努力。在繼代培養(yǎng)低溫保藏法中則需要注意更換培養(yǎng)基和配合菌種復(fù)壯等研究工作，對于高溫品種不能用常規(guī)的低溫保藏，以免菌種失活。因此結(jié)合長短期保藏方法能夠確保良種的有效保藏，保障產(chǎn)業(yè)用種安全。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，將在基因?qū)用嬖忈尵N退化的原因并且找到最終解決的方法。