血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元核因子-κB與環(huán)氧合酶-2水平的動(dòng)態(tài)變化

王 佳 楊俊卿 余麗娟 楊 彬 趙 磊 蔣青松

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室 重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

血管性癡呆(VD)是由缺血性和出血性腦血管疾病引起的獲得性智能障礙綜合征，現(xiàn)已成為老年期癡呆的重要組成部分。Clemens〔1〕用全腦缺血再灌注(GCIR)模型證明核因子κB(NF-κB)可能參與海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或死亡。非甾體抗炎藥可延緩老年期癡呆的病情發(fā)展，環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白在大鼠腦損傷中參與了神經(jīng)元的凋亡〔2〕，提示COX-2在血管性癡呆中可能有一定促進(jìn)作用。COX-2基因啟動(dòng)子序列中有2個(gè)κB位點(diǎn)，提示COX-2的作用與NF-κB緊密相關(guān)。翟鍇華等〔3〕亦提出NF-κB、COX-2蛋白的高表達(dá)可能是VD大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的原因之一。有學(xué)者分別觀察了GCIR大鼠海馬中NF-κB〔4〕或COX-2蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化〔2〕，但不同研究者得到的結(jié)果并不一致，其原因可能由于采用的動(dòng)物不同，或者缺血模型建立方式不同，或者觀察時(shí)間點(diǎn)差異等。這就需要在同一個(gè)GCIR動(dòng)物模型中同步觀察NF-κB與 COX-2的表達(dá)變化特征。本研究擬動(dòng)態(tài)觀察GCIR后海馬病理改變及NF-κB、 COX-2蛋白表達(dá)的時(shí)程。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性 SD大鼠，SPF級(jí)，200～250 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔動(dòng)物證書號(hào)：SCXK(渝)2010-0001〕。SPF環(huán)境飼養(yǎng)3 d。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組，GCIR 30 min、2、6、24、48、7、15 d組，每組12只。

1.2試劑 NF-κB p65多克隆抗體(Biworld ，BS5586)、免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，SA1022)、兔抗COX-2多克隆抗體(SANTA， SC-1745)。

1.3方法

1.3.1腦血流測(cè)定 大鼠以水合氯醛(400 mg/kg腹腔注射)麻醉,剪開頭部皮膚，暴露顱骨。將激光多普勒血流儀的探頭固定于顱骨上，進(jìn)行全腦缺血再灌注手術(shù)。激光多普勒血流儀記錄大鼠手術(shù)過(guò)程中的腦血流變化，缺血操作時(shí)腦血流值(CBF)下降到正常血流值40%以下為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2模型的建立 參照文獻(xiàn)〔5〕的方法，將水合氯醛(400 mg/kg腹腔注射)麻醉后的大鼠仰臥固定，頸正中切口。分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈與一側(cè)頸總靜脈。由頸總靜脈插管入心房，輸入肝素化生理鹽水。緩慢抽取每只大鼠總血容量體積分?jǐn)?shù)0.3的血液(大鼠體重不同而血容量也不同)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉20 min后松開動(dòng)脈夾，然后緩慢回輸血液，結(jié)扎頸總靜脈，縫合傷口。假手術(shù)組除不進(jìn)行抽血與夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其余手術(shù)操作同GCIR。手術(shù)過(guò)程中，大鼠體溫保持在36.5℃～37.2℃。

1.3.3大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 水迷宮測(cè)試分為兩個(gè)階段，第一階段為訓(xùn)練階段，第一次訓(xùn)練時(shí)將大鼠置于平臺(tái)上1 min。后將大鼠分別從A、B、C、D四個(gè)象限背對(duì)平臺(tái)入水，讓其自由游泳找到隱蔽于水中的平臺(tái)，觀察記錄其尋臺(tái)潛伏期， 180 s內(nèi)未找到平臺(tái)者將其尋臺(tái)潛伏期記為180 s。訓(xùn)練4 d，4次/d。第二階段為測(cè)試階段，第5天時(shí)，撤去平臺(tái)，從A、B、C、D四個(gè)象限隨機(jī)選定一個(gè)位置將大鼠放入水迷宮中，觀察并記錄大鼠尋臺(tái)潛伏期作為大鼠記憶成績(jī)。因?yàn)閯?dòng)物手術(shù)后傷口需要愈合，故僅對(duì)假手術(shù)組和GCIR 15 d兩組大鼠在第8～12天進(jìn)行水迷宮測(cè)試。

1.3.4組織病理學(xué)檢查 大鼠以水合氯醛(400 mg/kg腹腔注射)麻醉，仰臥位固定。剪開胸腔，剝離心包，頭皮針經(jīng)心尖刺入左心室，灌注肝素化生理鹽水，以肝臟作為血液與灌注液出口。注入4%多聚甲醛的磷酸緩沖液進(jìn)行在體腦組織固定。分離腦組織，4%多聚甲醛固定3 d，腦組織冠狀切片，厚約5 μm，HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目變化。400倍鏡下隨機(jī)選取相應(yīng)區(qū)域3個(gè)不重疊視野進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)(n=4)。

1.3.5大鼠海馬NF-κB p65免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)大鼠海馬組織NF-κB p65 的表達(dá)。按試劑盒說(shuō)明書操作，其中 NF-κB p65多克隆抗體(1∶500)，4℃過(guò)夜，DAB顯色。NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件在400倍視野下選取相應(yīng)區(qū)域3個(gè)不重疊視野檢測(cè)陽(yáng)性染色部位的積分光密度(IOD)值。按平均IOD=IOD/面積計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次取其平均值表示NF-κB的相對(duì)表達(dá)量(n=4)。

1.3.6Western印跡測(cè)定大鼠皮層COX-2 蛋白表達(dá) 提取大鼠海馬蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入COX-2抗體(1∶100) 或β-actin(1∶1 000),4℃過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次，辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光。以COX-2與β-actin的光密度比值作為COX-2蛋白的相對(duì)量(n=4)。

2 結(jié) 果

2.1模型大鼠手術(shù)中腦血流變化 夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈前，CBF為(276.15±13.37)PU ，缺血時(shí)降為(85.27±4.69)PU，降幅達(dá)到69.13%。夾閉完成后，血流迅速恢復(fù)接近至基線,均值為(239.53±9.88)PU，但未完全恢復(fù)至夾閉前水平。

2.2大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清楚完整，細(xì)胞排列層次分明。而GCIR大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的核固縮，細(xì)胞層次及數(shù)目明顯減少(圖1)。隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)核固縮的細(xì)胞數(shù)逐漸增多，海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡率增加，再灌注30 min、2、6、24、48 h分別為12.71±2.33、32.92±11.75、51.36±75.52、68.18±13.34、76.9±9.63；至第7天達(dá)到高峰(91.53±7.96)(P<0.01)，第15天略有下降(83.62±4.20)，但仍明顯高于假手術(shù)組(4.67±1.65)(P<0.01)。

圖1 GCIR大鼠海馬組織病理學(xué)改變(×400)

2.3GCIR對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與假手術(shù)組相比，訓(xùn)練階段與測(cè)試階段中，GCIR組大鼠尋臺(tái)潛伏期均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。隨著訓(xùn)練天數(shù)和訓(xùn)練次數(shù)的增加，兩組大鼠的尋臺(tái)潛伏期均明顯縮短，但模型組大鼠所用時(shí)間仍明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。

表1 VD大鼠尋臺(tái)潛伏期比較

2.4GCIR大鼠海馬NF-κB p65蛋白表達(dá)變化 免疫組化顯示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、層次分明， NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)較少，染色較淺，神經(jīng)元胞質(zhì)及核周呈淡黃色，胞核內(nèi)未見明顯染色。GCIR組大鼠海馬神經(jīng)元NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加、表達(dá)增強(qiáng)，陽(yáng)性表達(dá)由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，胞核深染呈棕黃色(圖3)。光密度值統(tǒng)計(jì)顯示，NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值再灌注30 min開始升高，24 h達(dá)峰值。隨后逐漸下降，但15 d后仍高于假手術(shù)組。見表2。

2.5全腦缺血再灌注大鼠海馬COX-2 蛋白表達(dá)的變化 與假手術(shù)組比較，GCIR組大鼠海馬組織中的COX-2蛋白表達(dá)水平于再灌注2 h顯著升高，7 d達(dá)峰值，15 d時(shí)下降，但仍明顯高于假手術(shù)組(圖3，表2)。

圖2 GCIR 大鼠海馬NF-κB蛋白表達(dá)變化(×400)

圖3 血管性癡呆大鼠海馬COX-2 蛋白表達(dá)變化

表2 VD大鼠海馬NF-κB和COX-2蛋白相對(duì)表述量

3 討 論

本研究從腦血流變化、學(xué)習(xí)記憶能力以及病理形態(tài)等方面均證明VD大鼠模型建立成功。

研究結(jié)果顯示，再灌注30 min～15 d，大鼠海馬NF-κB的活性明顯增加，可能是GCIR損傷后，早期的氧化應(yīng)激反應(yīng)使NF-κB活化轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)一系列炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，使促炎性的細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6等增多。而這些炎性細(xì)胞因子又可導(dǎo)致NF-κB活化，形成正反饋，促使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大，即NF-κB信號(hào)通路的正反饋調(diào)節(jié)〔6〕。再灌注第24小時(shí)后，NF-κB的活性下降，可能因?yàn)镮κB與活化的NF-κB結(jié)合，使其與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)脫離，重新轉(zhuǎn)位于細(xì)胞質(zhì)中，使NF-κB失活，即NF-κB信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)〔7〕。提示NF-κB過(guò)表達(dá)參與了GCIR全過(guò)程，而NF-κB抑制劑使用的時(shí)間窗最好在腦缺血再灌注24 h內(nèi)。已有研究證明，NF-κB的抑制劑吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)能使局灶性腦缺血的治療時(shí)間窗延長(zhǎng)〔8〕。

本研究中COX-2蛋白表達(dá)水平的變化與海馬神經(jīng)元損傷變化基本一致。已有研究發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑能減少神經(jīng)元凋亡〔9〕；在全腦缺血后24 h給予尼美舒利仍能挽救海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的死亡〔10〕；另一個(gè)高選擇性COX-2的抑制劑DFU也能改善全腦缺血再灌注7 d沙土鼠的自發(fā)性活動(dòng)〔11〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)，與NF-κB相似，COX-2表達(dá)參與了GCIR的病理生理過(guò)程，關(guān)系似乎比NF-κB更密切。

本研究還發(fā)現(xiàn)，VD大鼠海馬中NF-κB與 COX-2的時(shí)程變化并不同步；NF-κB的變化早于COX-2，而海馬神經(jīng)元的凋亡、學(xué)習(xí)記憶功能的受損與COX-2的變化時(shí)程基本一致，提示NF-κ B活化可能上調(diào)了VD大鼠海馬神經(jīng)元中COX-2表達(dá)水平，進(jìn)而參與腦損傷病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。

有趣的是，VD大鼠海馬神經(jīng)元NF-κB的活性在再灌注24 h達(dá)到峰值后逐漸下降，但COX-2 蛋白表達(dá)水平仍逐漸升高并維持較高水平。GCIR早期COX-2表達(dá)增加可能是由于早期NF-κB已經(jīng)活化，隨之激活了COX-2的表達(dá)；24 h后，NF-κB表達(dá)下降，但其活化后刺激TNF-α〔12〕和IL-6〔13〕增多，而TNF-α和IL-6也能激活COX-2的表達(dá)〔14〕，TNF-α和IL-6與NF-κB協(xié)同作用使再灌注24 h后COX-2蛋白繼續(xù)升高。

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