牦牛感染牛病毒性腹瀉病毒的診斷

任宜家

（青海省海北州祁連縣畜牧獸醫(yī)站 青海海北 810499）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，為牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）的致病原。BVDV的感染非常普遍，可以感染黃牛、水牛、牦牛和豬、羊等動(dòng)物，是當(dāng)前危害養(yǎng)牛業(yè)的重要病毒性傳染病之一。患病動(dòng)物和帶毒動(dòng)物為主要傳染源，病畜的分泌物和排泄物都含有病毒，病毒可通過(guò)接觸以及空氣水平傳播，還可以通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播，致使新生犢牛發(fā)生流產(chǎn)或死胎。不同飼養(yǎng)方式、品種和年齡的牛均易感，但對(duì)犢牛的危害最為嚴(yán)重，一年四季都可發(fā)生，冬末和春季高發(fā)。牦牛是我國(guó)高原牧區(qū)特有的一個(gè)獨(dú)立物種，牦牛全身是寶，其奶和肉可食用，毛皮可以制作皮革和衣服，糞便可以作為燃料，既可以用來(lái)農(nóng)耕也可以作為高原地區(qū)的交通工具，是當(dāng)前青海省農(nóng)村飼養(yǎng)的主要家畜，而牛病是一直困擾著基層牦牛養(yǎng)殖戶的棘手問(wèn)題，特別是BVDV感染常有發(fā)生。2018年3月，青海省西寧市某牧區(qū)的牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生一起以消瘦、食欲下降、發(fā)熱、黏膜糜爛和腹瀉為主要特征的疫病，通過(guò)臨床癥狀初步懷疑為BVDV感染，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)最終確診了疫情，為采取積極的治療措施提供了參考依據(jù)?，F(xiàn)將發(fā)生這起牦牛感染BVDV病例的整個(gè)診斷情況匯報(bào)如下。

1 臨床診斷

1.1 發(fā)病情況

該牦牛場(chǎng)共飼養(yǎng)牦牛100余頭，2018年3月，陸續(xù)有牦犢牛發(fā)生高熱、咳嗽、腹瀉和死亡，就診時(shí)已死亡犢牛3頭，發(fā)病后養(yǎng)殖場(chǎng)曾利用青霉素等抗生素進(jìn)行藥物治療，但效果不明顯。

1.2 臨床癥狀

發(fā)病牦牛表現(xiàn)食欲下降，被毛凌亂，發(fā)熱，體溫達(dá)42.0℃，咳嗽，眼鼻有漿液性分泌物，口腔黏膜糜爛，流涎，精神不振，發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，糞便惡臭、含少量血絲或黏膜，消瘦、脫水最后死亡。

1.3 剖檢病變

對(duì)病死牦牛剖檢可見(jiàn)食道黏膜糜爛，瘤胃黏膜有出血和糜爛，腸內(nèi)容物稀薄，腸壁薄，水腫，腸黏膜出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸、空腸和回腸都有炎性病變。根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀和剖檢觀察結(jié)果初步懷疑為BVDV感染，無(wú)菌采集脾及腸系膜淋巴結(jié)送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 核酸提取

將病料樣品按1:3比例加生理鹽水，用研磨器研磨成組織勻漿，取上清液利用病毒基因組RNA提取試劑盒（購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取核酸RNA。

2.2 一步法RT-PCR擴(kuò)增

以提取的RNA為模板，利用牛病毒性腹瀉病毒一步法RT-PCR診斷試劑盒（購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司）進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，一步法RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄40min；94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸6min；4℃終止反應(yīng)。

2.3 電泳檢測(cè)

一步法RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在紫外成像儀下觀察檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示在約258bp具有特異性核酸片段，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為BVDV陽(yáng)性。

3 綜合診斷結(jié)果

根據(jù)疾病的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)結(jié)果，確診該牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了BVDV感染。

4 討論

近年來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)特種動(dòng)物養(yǎng)殖的不斷扶持，牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展，但由于基層養(yǎng)殖單位疫病防控意識(shí)薄弱，致使牦牛疫病的流行率逐步增加，其中BVDV感染是危害當(dāng)前牦犢牛的主要疫病，給牦牛養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失，也制約著我國(guó)牦牛產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，加強(qiáng)牦牛BVDV的防控對(duì)保障牦牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展至關(guān)重要。BVDV感染可引起牦牛的發(fā)熱、咳嗽、腹瀉以及懷孕母牛流產(chǎn)等臨床表現(xiàn)，臨床中一般可以根據(jù)這些特征進(jìn)行初步診斷，但在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，由于牛的體質(zhì)和感染狀態(tài)不同，一般發(fā)病癥狀并不明顯，且臨床中BVDV引起的臨床表現(xiàn)與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌引起的腹瀉極其相似，憑借肉眼觀察或者臨床經(jīng)驗(yàn)只能進(jìn)行初診，確診必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷。目前BVDV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括常規(guī)RT-PCR、一步法RT-PCR、熒光定量RT-PCR、病毒分離培養(yǎng)、病毒中和試驗(yàn)、ELISA方法等，其中以RT-PCR檢測(cè)方法操作最簡(jiǎn)單、檢測(cè)最快速，且RT-PCR方法可以檢測(cè)到不同病原體特定的核苷酸序列，大大提高了BVDV的檢出率和準(zhǔn)確率。而一步法RT-PCR檢測(cè)方法將反轉(zhuǎn)錄過(guò)程和PCR擴(kuò)增過(guò)程簡(jiǎn)化至一步反應(yīng)，解決了常規(guī)RT-PCR方法需要反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分開(kāi)進(jìn)行的缺陷，大大降低了檢測(cè)成本、減少了檢測(cè)操作、縮短了檢測(cè)時(shí)間，鑒于此，本研究利用一步法RTPCR檢測(cè)試劑盒對(duì)病例進(jìn)行確診，為養(yǎng)殖場(chǎng)采取積極的治療措施贏得了時(shí)間。養(yǎng)殖場(chǎng)根據(jù)確診結(jié)果通過(guò)緊急采取隔離飼養(yǎng)、環(huán)境消毒、疫苗免疫接種、補(bǔ)液、對(duì)癥治療以及應(yīng)用磺胺類藥物防止繼發(fā)細(xì)菌感染等綜合性防控措施，養(yǎng)牛場(chǎng)病牛逐漸康復(fù)，此次疫情得到了有效控制。

BVDV通過(guò)侵入牛的呼吸道及消化道黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，病毒入血后可以形成病毒血癥，BVDV能通過(guò)胎盤(pán)屏障，妊娠母牛感染后會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)，或產(chǎn)下有先天性缺陷的犢牛，如小腦發(fā)育不全等。BVDV感染后會(huì)導(dǎo)致免疫抑制，本病可以在牛群中潛伏感染，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)發(fā)病。BVDV的垂直感染以及免疫抑制增加了BVDV防控的難度，且臨床中BVDV與各種細(xì)菌病混合感染的情況經(jīng)常發(fā)生，一旦發(fā)生混合感染將大大提高BVDV的致死率。對(duì)于BVDV的防控一般應(yīng)采取以預(yù)防為主的綜合性防控措施，要求養(yǎng)殖場(chǎng)一定要搞好環(huán)境衛(wèi)生，保持牛舍的空氣清潔，保證良好的通風(fēng)，牛糞便要及時(shí)清理，防止與其他病原菌混合感染，做好疫苗免疫接種和血清學(xué)監(jiān)測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性牛要及時(shí)淘汰，做好牛群的凈化工作。發(fā)病牛要盡早隔離飼養(yǎng)，對(duì)癥治療，給予補(bǔ)液和止瀉處理，同時(shí)給予抗生素和抗病毒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，防止繼發(fā)感染和脫水死亡。■